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Shanghai Yise Medical Technology Co.,Ltd.
《一步法恒溫支原體檢?測試劑盒》主要用于檢測細胞培養上清或別的液體樣品中是否含有支原體污染，該試劑盒僅用于基礎科研。
《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》采用獨特的恒溫基因擴增技術和顯色技術，對樣品的支原體基因組DNA進行恒溫擴增，反應完后，通過反應管的顏色即可對結果進行判斷。
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《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》八大優點
?（1） 極端方便，整個檢測過程只需一步即可完成。
（2） 極端省時，整個檢測過程只需1小時，而PCR法通常需要2-3小時。
（3）靈敏度良好，一般比30個循環普通PCR靈敏度高。
（4）無需樣品的前處理。由于細胞培養數天后，培養液中經常含有嚴重抑制PCR擴增的代謝物，所以樣品的前處理一般是PCR法不可或缺的環節。而RD-RCA擴增不受抑制，無需樣品的前處理。
（5）無需樣品的離心濃縮，檢測只需1微升培養液即可。
（6）無需用到PCR儀、電泳槽、凝膠成像儀、離心機等儀器，整個檢測只需一個水浴鍋即可完成。
（7）無需電泳，無需接觸EB等誘癌物質。根據反應管的指示劑，肉眼即可判斷反應結果。
（8）產品穩定性極好，凍干型產品可以在室溫至少放置2個月，-20 ℃至少可以放置2年。
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將有支原體污染的細胞培養液上清用水做系列稀釋（RD-RCA做10倍系列稀釋、PCR做5倍系列稀釋），而后分別用《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》和普通PCR進行支原體檢測。
?如右圖所示，采用RD-RCA法的《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》在稀釋10000倍后仍呈明顯的陽性而普通PCR(30 cycles)在稀釋125倍后呈勉強的弱陽性，二者靈敏度至少相差80倍。
另外一個值得高度注意的是：用細胞培養上清原液進行PCR檢測居然呈明顯的陰性！而原液用水稀釋5倍后，PCR卻呈陽性。說明：細胞培養上清原液含有強烈抑制PCR的代謝物！
與此形成鮮明對比的是：采用RD-RCA法的《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》卻能在細胞培養上清原液中檢測出支原體污染！說明：同樣的代謝產物雖然強烈抑制PCR卻不會抑制RD-RCA的正常擴增。
這是RD-RCA法的巨大優勢！如此，RD-RCA就不需要進行樣品的稀釋或者進行支原體DNA的抽提等的前處理。
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特別提醒：
該實驗也說明：如果使用的PCR法支原體檢測試劑盒沒有內參對照，而直接使用細胞培??養上清原液進行PCR檢測，檢測結果即使為陰性，也不能說明其沒有支原體污染，極有可能是PCR的擴增被細胞的代謝產物抑制了！這個問題絕大部分進行支原體檢測的人員都不會注意，這是利用無內參對照的PCR法進行支原體檢測的致命弱點!
【注：由于本公司現在生產的《PCR法支原體檢測試劑盒》（貨號：PM008），含內參對照，已經可以區分真陰性樣品（樣品無支原體污染。電泳結果：有內參條帶，無支原體特異條帶）和假陰性樣品（PCR被代謝產物抑制。電泳結果：內參條帶和支原體特異條帶都沒有）。詳情請參考本公司生產的《PCR法支原體檢測試劑盒》說明書】
有關PCR的擴增會被細胞的代謝產物抑制的問題，Sigma公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit（貨號MP0035-1 kit）的PCR法支原體檢測試劑盒說明書中也特別提到了這點，其強烈建議用試劑盒進行DNA提取后再進行檢測?？梢娺@是利用PCR法進行支原體檢測過程中普遍遇到的問題，應該引起科研工作者的高度重視！否則，由此引起的假陰性（培養時間越久，概率越高），將使無內參對照的PCR法進行的支原體檢測變得毫無意義！?
本公司所有恒溫基因檢測產品主要以凍干品的形式提供（如右圖所示）。《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》同樣以凍干品的形式提供。
采用凍干技術，將所有擴增成分都凍干在一個0.2 mL的PCR管中，使用時只需加入水化液和待測樣品，整個檢測過程一步即可完成，非常簡單。
此外，由于凍干品的穩定性非常好，可以在室溫保存至少2個月，這樣非常方便運輸和儲存，也非常適合在野外或者污染點進行即時檢測。該工藝的創新極大的擴展了相關產品的市場應用前景。
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?產品重要信息
（1）產品價格：《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》（貨號：MD001）；價格：800元/50次（平均每個樣品16元）。
（2）產品說明書： PDF版說明書，請到本公司網站“下載中心”頁面下載?。▋龈尚彤a品暫停供應）。
（3）方法學報告：《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》方法學報告，請到本公司網站“下載中心”頁面下載！
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細胞培養專用《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》（溶液型）
使用說明書（版本20220529）
【本說明書會不定期更新，每次收到新的產品時，請到本公司網站重新下載最新版本！】
貨號
MD001
包裝規格
50次/盒
儲存條件
該產品隨冰袋運輸，收到產品后請立即放-20 ℃冰箱保存，該條件下，至少3年內仍然有活性。
產品用途
《一步恒溫法支原體檢測試劑盒》（One-step Quickcolor Mycoplasma Detection Kit）主要用于檢測細胞培養液或別的液體樣品中是否含有支原體。本產品僅供科研使用。
產品簡介
哺乳動物細胞的培養，支原體（Mycoplasma）污染是個世界性的問題。支原體污染幾乎可以改變細胞的所有參數，導致實驗結果的不準確、甚至完全錯誤（支原體污染對細胞的詳細危害，請參考本公司的網站：www.stylediaryblog.com）。從2013年開始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及細胞培養都要進行支原體檢測。相信會有越來越多的高水平期刊將做出同樣的支原體檢測要求。
培養法是相對可靠的支原體檢測技術，但是該方法非常耗時的，需要數周，不適合作為細胞培養液中支原體污染的快速檢測。此外，通過固體培養法無法檢測污染細胞的一種最常見的支原體，即豬鼻支原體（M.Hyorhinis）。這是因為豬鼻支原體無法在支原體固體培養基上形成可見的菌落。而豬鼻支原體約占所有支原體污染的20-50%。
有的實驗室使用熒光染色法檢測支原體，但是該方法靈敏度太低，而且嚴重依賴實驗人員的經驗，實驗的穩定性極差。此外，當該方法檢測成陽性時，細胞經常已經嚴重污染。
培養法和熒光染色法雖然是我國藥典收錄的支原體檢測方法，但是因為其各自都有明顯的缺點，不適合作為支原體快速檢測的方法。
本公司目前已經開發出四種不同原理的快速支原體檢測試劑盒，分別是：《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》、《發光法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》，其各自都有自己的優缺點（詳情請參考本公司網站）。
? 《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》使用獨特的恒溫基因擴增技術，有明顯的優點：（1）整個檢測過程只需1小時，大大縮短了檢測時間；（2）未發現細胞培養液中的PCR抑制劑會抑制恒溫基因擴增，所以一般無需進行樣品的前處理；（3）恒溫基因擴增的靈敏度良好，一般比30個循環普通PCR法高；（4）恒溫基因擴增的產物無需電泳，可以通過指示劑的顏色變化直接肉眼判斷反應結果；（5）無需用到PCR儀、電泳槽、凝膠成像儀等儀器，整個檢測過程只需一個水浴鍋。
《一步恒溫法支原體檢測試劑盒》主要缺點：（1）支原體識別率相對較低，大約只能識別污染細胞所有支原體種類的99%左右，還有大約1%的支原體可能無法識別，從而導致假陰性；（2）高濃度的血清和相關血液制品、二價離子和EDTA等可能會對顯色結果產生干擾（注：可以通過離心清洗去除干擾），導致結果誤判。
經測試，本試劑盒至少可以檢測以下13種支原體：（1）M. hyorhinis、（2）M. fermentans、（3）M. arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M. pirum、（8）A. laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M. bovis、（11）M. buccale、（12）M. arthritidis、（13）M. pulmonis（注：M.為Mycoplasma的縮寫；A.為Acholeplasma的縮寫）。其中，前8種為是最常見的污染細胞的支原體種類，約占污染細胞的支原體的98%左右。以上13種約占污染細胞的支原體種類的99%左右（注：目前文獻報道，體外細胞支原體污染的種類大概有19-20種，具體支原體種類請看本公司《PCR法支原體檢測試劑盒》說明書）。注意：本試劑盒無法檢測Ureaplasma Urealyticum支原體（注：該支原體污染細胞的概率極低）！
《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》的檢測靈敏度：經測試，在每個反應管的DNA加入量為2 μL的情況下，《一步恒溫法支原體檢測試劑盒》的最高檢測靈敏度（即檢測下限）大約在20-400個copies，即10-200 copies/μL?？梢酝ㄟ^離心濃縮、提取支原體基因組DNA等措施，其檢測靈敏度可以在此基礎上繼續提高10-100倍。
由于任何一種快速支原體檢測方法都無法保證檢測結果100%正確，如果您想得到100%正確的支原體檢測結果（比如，開展細胞治療的客戶，進行干細胞培養的客戶，生產血清、胰酶、培養液的客戶，出售各種原代培養細胞系和腫瘤細胞系的客戶等），任選本公司生產的《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》、《發光法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》中的兩種進行檢測，將會得到比較滿意的結果。如果幾種不同支原體檢測方法的檢測結果一致，正確率幾乎就是100%。
試劑盒組成
（1）溶液1：1150 μL （50次檢測）；
（2）溶液2：55 μL；
（3）溶液3：指示劑，38 μL
（4）陽性支原體DNA：50 μL；
（5）礦物油：1500 μL。
? 需要自己準備的耗材：（1）0.2 mL透明度良好的平蓋PCR管；（2）200 μL和10 μL 濾芯吸頭（比如Axygen公司）。以上兩種耗材可以在淘寶網購買。
檢測過程
1. 待測樣品的準備：
為了準確判斷細胞是否有支原體的污染，待測的細胞培養液樣品需要取自換液后培養2-3天且匯合度在90%左右的細胞培養液上清（貼壁細胞）。懸浮培養的細胞也需要在換液傳代后，讓細胞生長2-3天再取培養液進行檢測?？梢园凑找韵聝煞N方法之一進行樣品的前處理：
方法一：直接檢測（該方法無法去除可能的干擾物，顯色被干擾的可能性相對較大）：
（1）取150 μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內，在普通臺式離心機上1000 rpm (大約150 g)低速離心5 minutes，取離心后的上清100 μL用于支原體檢測，丟棄下層剩余的50 μL（含細胞沉淀）。
（2）已經離心去除細胞的待測樣品可以直接檢測，也可以進行熱處理后再檢測（熱處理后，樣品保存更穩定），具體如下：95 ℃加熱處理5 minutes（可以轉移到PCR管內，在PCR儀上進行加熱處理），簡單離心（1000 g，5 seconds）后，取上清進行檢測。
方法二：簡單離心清洗（推薦方法。該方法不僅可以濃縮支原體從而提高檢測的相對靈敏度，還可以去除絕大部分可能的干擾物，顯色被干擾的可能性極小。如果該簡單一步離心清洗的方法仍然無法去除干擾物，可以使用后文注意事項部分的三步離心清洗的方法。）：
（1）根據濃縮倍數，可以取100 - 1500 μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內，在普通臺式離心機上1000 rpm (大約150 g)低速離心5 minutes，將離心后的上清轉移到另一個離心管內，丟棄細胞沉淀。
（2）將上清繼續13000 rpm（約16000 g）高速離心5 minutes，小心吸走全部上清（為避免碰到底部沉淀，可以保留底部3-5 μL液體），用20-50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8（樣品可以長期保存。推薦）或者去離子水（樣品比較不穩定，只適合當天或短期內檢測使用）重懸沉淀（沉淀中含有支原體），吹吸均勻【如果最初使用了1500 μL的樣品而最后用20 μL重懸，則支原體濃度大約提高了75倍，相對靈敏度也提高了75倍】。
（3）該重懸后的樣品可以直接檢測，也可以進行熱處理后再檢測（熱處理后，樣品保存更穩定）。熱處理具體如下：95 ℃加熱處理5 minutes（可以轉移到PCR管內，在PCR儀上進行加熱處理），簡單離心（1000 g，5 seconds）后，取上清進行檢測。
? 注1：這里的細胞培養上清不是指細胞經胰酶消化后的離心上清，而是指至少培養2天后的貼壁細胞培養液上清（不需要胰酶消化，也不能取經胰酶消化后的離心上清進行檢測）或懸浮細胞培養液。
? 注2：本步驟的低速離心是為了去除哺乳動物細胞，以排除其不必要的干擾。所以離心力要嚴格控制在150-200 g，該離心力下，哺乳動物細胞將被沉淀下來而支原體不會。如果錯誤使用更高的離心力將可能導致支原體也被離心下來，從而導致假陰性。
? 注3：收集的待測細胞培養液樣品如果不立即檢測，請放于-20℃或-80℃冰箱保存，不得放于室溫或4℃冰箱。樣品在-20℃至少可以保存一個月，在-80℃可以長期保存。此外，為了節約檢測成本，可以將不同時間收集的樣品放于-20℃或-80℃冰箱保存，而后一起檢測。
? 注4：如果預期待測樣品支原體含量較少（比如，低溫保存的血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養液、生物制品、極個別細胞培養上清等），可以采取措施以提高檢測的靈敏度，具體方法請看后文注意事項部分：如果提高本試劑盒檢測靈敏度。
2. 反應體系的配制【本步驟所有操作強烈建議使用進口濾芯吸頭（比如Axygen濾芯吸頭）進行操作，以避免試劑被污染。操作之前，請認真看完后文的注意事項后，再進行操作】：
（1）將溶液1和溶液3從-20 ℃冰箱中取出，室溫融化后，開蓋之前，甩動溶液1的離心管將管壁溶液甩到管底，而溶液3必須離心（大約3000 rpm，離心1分鐘）一下，吹吸均勻后【注：溶液1和溶液3每次融化后都必須吹吸均勻后再吸取，溶液2和溶液3開蓋之前，請離心一下】，按表1進行反應體系的配制：
具體配置體系，請根據PDF版說明書進行操作！
（2）將上述配制好的恒溫反應體系，吹打均勻后，按每管24 μL分裝到0.2 mL的PCR管中。
? 注：1）盡量保證每管的反應液體積一樣。如果分裝時最后一管反應液不足，可以將其作為陰性對照管；2）PCR管應該使用透明度良好的PCR管。
（3）陰性對照管（Negative）可以不加，也可以加入1 μL滅菌水（建議不加）；往測試管（Test）中加入1-2 μL待測樣品（前處理使用方法一的，建議加1 μL；前處理使用方法二的，建議加2 μL）；往陽性對照管（Positive）中加入1 μL陽性支原體DNA。反應液的總體積為25 μL。
? 注：1）裝有陽性支原體DNA的螺口管請不要高速離心，開蓋之前，只要用手指捏住，用力甩一下即可。吸取之前，請吹吸均勻后再吸取。如果不小心高速離心了，務必吹吸均勻后再吸取，否則陽性對照結果可能異常。2）進行反應體系配制的房間，與樣品前處理、加陽性對照DNA、樣品DNA的房間最好分開。
3. 反應（選擇以下方式之一進行反應）：
（1）水浴內反應（注意：本產品只能使用含水的普通水浴鍋，不能在沒有水的純金屬浴內反應，因為沒有水的純金屬浴溫度非常不準確。）：往每個反應管內加入25 μL礦物油，以防止水份揮發，蓋上蓋子，將反應管插入帶孔的漂板內，放入已經升溫到61℃的普通水浴內，準確反應60分鐘。
? 注：在反應之前，水浴鍋必須先升溫到61℃，再放入反應管。此外，必須用水銀溫度計測量水溫，確保水浴鍋的溫度準確。本試劑盒所用的酶對溫度非常敏感，只允許儀器顯示溫度與實際溫度的溫差不超過1℃。
（2）PCR儀上反應：有PCR儀的實驗室，強烈建議在PCR儀上進行反應，這樣可以準確控制反應的時間和溫度。PCR儀參數如下：61 ℃，60 min；10 ℃, forever；熱蓋溫度，105 ℃。
? 注：在帶熱蓋的PCR儀上進行反應，無需在反應管內加入礦物油（現在的PCR儀基本都是帶熱蓋的）。
4. 結果判斷：61℃反應60分鐘后，立刻取出反應管，放于室溫。以一張白紙或白色泡沫盒（優選白色泡沫）為背景，通過反應管溶液顏色的變化，即可判斷檢測結果。如果溶液為藍綠色，則說明有支原體污染；如果為紫紅色，則說明沒有支原體污染（如圖1）。
? 注1：在61℃反應的時間必須準確計時，超過說明書規定的反應時間可能會出現假陽性（最多不得超過5分鐘）。如果試劑盒已經過期或者發生其他意外情況影響酶活性時，萬一發現：61℃反應60分鐘后，陽性和陰性顏色區別不明顯，可以考慮將已經反應60分鐘的反應管，繼續在61℃的水浴或PCR儀上反應10分鐘。但是如果61℃反應60分鐘后，陽性與陰性的區別一眼就可以看出，不得繼續反應，否則可能出現假陽性。以上只是意外情況下的補救措施。
? 注2：如果反應后，發現個別樣品的顏色介于陽性和陰性之間（正常這種情況應該概率很低，如果經常出現，樣品中可能含有可干擾正常指示效果的物質，必須先去除。去除方法見后文注意事項部分），可以將這些樣品繼續61℃反應10分鐘。10分鐘后，如果其顏色仍然與陽性對照的顏色不同，該樣品應該判為陰性。這種可疑樣品建議用相同試劑盒或者不同原理的其他試劑盒（如本公司的《PCR法支原體檢測試劑盒》、《發光法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》）進行復檢。
? 注3：反應后，請勿打開反應管的蓋子，否則有可能造成檢測環境的污染。結果判斷完后，將其用自封袋密閉，扔到另外一個房間的垃圾桶內。
? 注4：不同批次的產品，以及由于拍照等原因，反應后陽性對照和陰性對照的顏色可能會與本說明書書圖1的顏色略有差異（比如陰性對照顏色可能呈現淺紅色或紫紅色）。只要反應后陽性對照與陰性對照的顏色有顯著區別，就說明反應成功。
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圖1. 左邊為陰性反應結果，右邊為陽性反應結果。
注意事項
1. 請確保樣品加入后，反應之前：陰性、陽性和所有待測樣品的顏色基本一致。如果個別樣品，一旦加入，反應管的顏色就與陰性、陽性明顯不同，說明其中含有可干擾本系統正常指示效果的物質，必須先去除。此現象曾經在檢測CHO無血清培養基和一些血液制品（比如：白蛋白溶液、血漿原液、血清原液等）上發生過。常見的DMEM、MEM、F12、1640等培養基（可以含10%血清）一般不會發生該現象。去除方法：（1）離心清洗：取1 mL細胞上清或待測樣品（比如：白蛋白溶液、血漿原液、血清原液），先13000 rpm離心5 min，吸走950 μL上清；加PBS 950 μL，再次離心，吸走950 μL上清；再加PBS 950 μL，第三次離心，小心吸走全部上清（為避免碰到底部沉淀，可以保留底部3-5 μL液體），用20-50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8（樣品可以長期保存。推薦）或者去離子水（樣品比較不穩定，只適合當天或短期內檢測使用）重懸沉淀，吹吸均勻。該重懸后的樣品可以直接檢測，也可以進行熱處理后再檢測（熱處理后，樣品保存更穩定）。熱處理具體如下：95 ℃加熱處理5 minutes（可以轉移到PCR管內，在PCR儀上進行加熱處理），簡單離心（1000 g，5 seconds）后，取上清進行檢測。由于離心清洗可能導致支原體部分丟失，如果樣品支原體含量很低，可能導致漏檢。（2）使用本公司《支原體基因組DNA提取試劑盒》提取支原體DNA后進行檢測。通過DNA提取，即可以將所有可能的干擾物質全部去除，又可以將支原體DNA濃縮10-100倍。
2. 由于恒溫擴增所用的各種酶強烈依賴溶液中的二價離子，待測樣品的EDTA等金屬離子螯合劑只能微量存在。如果打算用試劑盒提取支原體DNA（推薦使用本公司《支原體基因組DNA提取試劑盒》），請用去離子水或者不含EDTA的5 mM Tris.HCl（pH 8.0-8.8）的緩沖液洗脫和溶解DNA。
3. 防DNA污染注意事項：
（1）恒溫反應體系配制的房間（本試劑盒請在有窗戶、通風良好的普通房間操作。請勿在密閉的細胞培養間進行該步驟的操作，因為細胞培養間支原體污染概率很高），與用于樣品前處理、加陽性對照DNA、樣品DNA的房間一定要分開。
（2）強烈建議使用濾芯吸頭（比如Axygen濾芯吸頭）吸取相關溶液和陽性支原體等。如果沒有濾芯吸頭，至少應該使用新開封的吸頭。
（3）必須確保使用的移液槍本身沒有殘留的支原體。因此，最好使用全新購買的移液槍。如果沒有新購買的移液槍，至少應該使用以前沒有進行過細胞培養的移液槍。因為進行過細胞培養的移液槍極有可能被含支原體的培養液污染（如細胞培養時，不小心將含支原體污染的培養液吸入移液槍的槍體內）。移液槍中吸附的支原體有可能造成不必要的假陽性。
（4）樣品前處理的各類吸頭、離心管，以及吸取陽性對照DNA、待測樣品DNA的吸頭，務必小心處理，請將其裝入含有半瓶水的帶蓋的、可密封的瓶子內，全部樣品吸取完后，蓋上瓶蓋，以防止陽性DNA的揮發，造成環境的污染，進而造成假陽性。
（5）整個操作過程，最好不要說話，因為人的口腔和唾液都是帶支原體的。
（6）反應后，請勿打開反應管的蓋子，否則有可能造成檢測環境的污染。結果判斷完后，將其用自封袋密閉，扔到另外一個房間的垃圾桶內。
4. 本試劑盒的檢測準確率：（1）由于本試劑盒能識別的支原體大概只占了污染細胞的支原體的99%左右，還有1%左右的污染細胞的支原體有可能不認識，這可能會導致1%左右的假陰性（漏檢）。（2）由于人體的口腔、皮膚和尿道都是含有支原體的，而且常用的腫瘤細胞系支原體污染率非常高，一般在15-90%之間，導致實驗室環境甚至移液槍也經常含有支原體，這可能導致出現極個別的假陽性（多檢，正常這種概率應該低于1%）?？傮w來說，單獨使用本試劑盒有可能出現1-2%左右的錯誤率（注意：細胞培養中支原體出現的概率是來自文獻數據，是大量體外細胞培養支原體污染調查的結果。如果你們實驗室細胞污染的恰巧是出現概率比較低而本試劑盒又不認識的支原體，漏檢的概率會大幅度上升。因此：對所有重要的樣品（比如，可能用于人體的細胞），不能只依靠本試劑盒就下最終檢測結論，必須至少同時使用另外一種支原體識別率為100%的支原體檢測試劑盒【比如本公司《PCR法支原體檢測試劑盒》或《探針法支原體檢測試劑盒》】進行檢測，互相驗證?。?。為了提高檢測的準確率，建議客戶采取以下兩種措施：第一，對所有本試劑盒檢測出的陽性樣品，利用本試劑盒或者其他不同原理的支原體檢測試劑盒進行復檢（復檢可以基本排除因環境污染導致的假陽性），或者檢測時所有樣品直接使用兩個反應管同時檢測檢測，只有同一個樣品兩個反應管的檢測結果都為陽性時，才能判斷為真正的陽性樣品。第二，對所有重要的樣品（比如，可能用于人體的細胞），必須至少同時使用兩種（甚至三種）不同原理的支原體檢測試劑盒（其中一種方法推薦使用支原體識別率為100%的《PCR法支原體檢測試劑盒》或《探針法支原體檢測試劑盒》）進行檢測，互相驗證。
5. 如發現細胞被支原體污染，本公司提供細胞專用支原體清除和預防試劑，以及水浴專用殺菌劑和環境專用殺菌劑。
6. 支原體檢測樣品可以分成兩類：第一類，用含血清的培養液培養的哺乳動物細胞上清液，由于該條件非常適合支原體生長，培養數天后，支原體密度一般較高，可達107-9/mL，可以直接檢測。第二類，低溫保存的血漿、血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養液等樣品，由于這些樣品即使有支原體污染，支原體含量一般很少，直接使用快速支原體檢測試劑盒進行檢測，往往檢測不出來。這些樣品建議：（1）對樣品的支原體進行離心濃縮或者使用本公司《支原體基因組DNA提取試劑盒》將支原體DNA濃縮提取，該兩種方法大約可以將檢測靈敏度繼續提高10-100倍。該方法速度快，當天出結果，但是可靠性不如后面的培養法。（2）使用支原體液體培養基（必須同時接種不含精氨酸和含精氨酸的兩種支原體液體培養基）培養3-7天后，再進行檢測。具體方法請參考本公司《發光法支原體檢測試劑盒》說明書中最后的注意事項部分。該方法速度較慢，需要3-7天，但是可靠性高。
7. 如何提高本試劑盒檢測靈敏度：如果預期待測樣品支原體含量較少（比如，低溫保存的血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養液、生物制品、極個別細胞培養上清等），可以采取以下幾種措施：（1）通過使用本公司《支原體基因組DNA提取試劑盒》，將支原體DNA濃縮提取后再進行檢測（提取過程還可以把所有可能的PCR抑制劑全部去除），大約可以將檢測靈敏度提高10-100倍。（2）對支原體進行離心濃縮：取1 mL細胞上清，先13000 rpm（約16000 g）離心5 minutes，吸走全部上清，用50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重懸沉淀，95 ℃加熱處理5 minutes，簡單離心后（1000 g，5 seconds），取上清進行檢測。該離心濃縮過程大約可以將檢測靈敏度提高20倍。
我們選取了比較有代表性的4種支原體（分別是：M. hyorhinis，M. fermentans A. laidlawii和M. pirum），使用含相應支原體基因片段的質粒載體，經DNA定量后，計算出相應的分子數。
圖2. 四種支原體質粒和一種支原體基因組DNA 經4倍系列稀釋的恒溫擴增反應結果。每個稀釋度做2個重復，每個反應管的DNA加入量為2μL。從結果可知：《一步恒溫法支原體檢測試劑盒》的檢測下限范圍較寬，對于不同的支原體檢測下限有較大區別，從最低的大約20 copies【即大約10 copies/μL】（圖1A和1B）到大約120-400 copies【即大約60-200 copies/μL】（圖1C-1D）?？赡艿脑蚴牵海?/span>1）恒溫擴增需要多條引物同時起作用，而每種支原體的核酸序列會有所不同，導致不同支原體的擴增效率有一定區別；（2）本試劑盒使用了多套不同的引物，每套引物的擴增效率也會有所區別。我們正在評估是否需要對其中擴增效率較低的引物組進行優化升級。如果有優化升級，后續產品說明書和方法學報告中會有明確說明。
注：《一步恒溫法支原體檢測試劑盒》檢測靈敏度詳細數據，請參考其方法學報告。