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Shanghai Yise Medical Technology Co.,Ltd.

《探針法支原體檢測試劑盒》產品重要信息

（1）產品價格：《探針法支原體檢測試劑盒》?（貨號：QM016）；價格：1300元/50次（平均每個樣品26元）。

（2）產品說明書： PDF版說明書，請到本公司網站“下載中心”頁面下載！

（3）方法學報告： ?《探針法支原體檢測試劑盒》方法學報告，請到本公司網站“下載中心”頁面下載！

《探針法支原體檢測試劑盒》（含內參）說明書（版本20220801）

 

【本說明書會不定期更新，每次收到新的產品時，請到本公司網站重新下載最新版本！】

 

貨號

QM016

包裝規格

50次/盒

儲存條件

該產品在常溫或隨冰袋運輸，收到產品后，請立即放-20 ℃冰箱低溫避光保存。該條件下，至少5年內有效。

產品用途                                                                                            

《探針法支原體檢測試劑盒》（qPCR Mycoplasma Detection Kit with Probe）采用支原體特異性引物和支原體特異性熒光探針（報告基因為FAM），用于對樣品的支原體基因組DNA進行熒光定量PCR擴增檢測。

試劑盒內同時含有內參對照質粒mycoIC2和相應的引物和熒光探針（報告基因為VIC），用于監控支原體DNA提取和qPCR擴增的效率。

本試劑盒可用于檢測一切可能含支原體的樣品，比如：（1）體外細胞培養的上清；（2）血清；（3）各種體液，如唾液、尿液、鼻腔分泌物等；（4）別的液體樣品。本產品僅供研究使用。

產品簡介

哺乳動物細胞的培養，支原體（Mycoplasma）污染是個世界性的問題。支原體污染幾乎可以改變細胞的所有參數，導致實驗結果的不準確、甚至完全錯誤（支原體污染對細胞的詳細危害，請參考本公司的網站：www.stylediaryblog.com）。從2013年開始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及細胞培養都要進行支原體檢測。相信會有越來越多的高水平期刊將做出同樣的支原體檢測要求。

培養法是相對可靠的支原體檢測技術，但是該方法非常耗時的，需要數周，不適合作為細胞培養液中支原體污染的快速檢測。此外，通過固體培養法無法檢測污染細胞的一種最常見的支原體，即豬鼻支原體（M.Hyorhinis）。這是因為豬鼻支原體無法在支原體固體培養基上形成可見的菌落。而豬鼻支原體約占所有支原體污染的20-50%。

有的實驗室使用熒光染色法檢測支原體，但是該方法靈敏度太低，當檢測成陽性時，細胞經常已經嚴重污染。

培養法和熒光染色法雖然是我國藥典收錄的支原體檢測方法，但是因為其各自都有明顯的缺點，不適合作為支原體快速檢測的方法。

本公司目前已經開發出四種不同原理的快速支原體檢測試劑盒，分別是：《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》、《發光法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》，其各自都有自己的優缺點（詳情請參考本公司網站）。

《探針法支原體檢測試劑盒》具有100%支原體識別率、最高的檢測靈敏度、最高的檢測正確率、含內參對照從而可以區分真陰性樣品和假陰性樣品等一系列優點，該方法被認為是支原體快速檢測的金標準。如果您實驗室已經擁有（或者打算購買）熒光定量PCR儀，我們強烈推薦您選擇《探針法支原體檢測試劑盒》。

《探針法支原體檢測試劑盒》主要缺點：方法本身沒有明顯缺點，配套儀器相對昂貴。

經測試，本公司開發的《探針法支原體檢測試劑盒》至少可以識別在體外細胞培養中曾經報道出現的20種支原體，根據文獻報道，這些支原體基本上占污染細胞的支原體種類的100%。具體如下：（1）M. hyorhinis、（2）M. fermentans、（3）M. arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M.pirum、（8）A. laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M. bovis、(11) M. bovoculi、（12）A. axanthum、（13）M. buccale、 (14) M. pneumoniae、（15）M. arthritidis、（16）M. pulmonis、（17）M. gallisepticum、（18）M. gallinarum、（19）M. canis、（20）Ureaplasma urealyticum（注：M.為Mycoplasma的縮寫；A.為Acholeplasma的縮寫）。根據支原體DNA的序列，本試劑盒可以識別100多種至今已發現的支原體，具有廣譜的識別能力。如果客戶發現除上述20種支原體外，還有其他的支原體也會污染體外培養的細胞，或者客戶純粹就是想檢測其他的支原體，請告訴我們支原體的名稱，我們將進行序列比對，然后告訴你本試劑是否可以識別。

《探針法支原體檢測試劑盒》檢測靈敏度：經測試，在每個反應管的DNA加入量為2μL的情況下，本試劑盒的最高檢測靈敏度（即檢測下限）大約在4-16 copies，即2-8 copies/μL?？梢酝ㄟ^離心濃縮、提取支原體基因組DNA、增加每個反應管中的DNA加入量等措施，其檢測靈敏度可以在此基礎上繼續提高10-1000倍。

此外，作為支原體檢測領域的共識，單獨使用任何一種支原體檢測方法，都無法做到100%正確，既不會漏檢（假陰性），也不會多檢（假陽性）。嚴格的支原體檢測，至少需要使用兩種（最好使用三種）不同原理的支原體檢測方法同時進行檢測，才能使檢測結果接近100%正確。

如果您想得到100%正確的支原體檢測結果（比如，開展細胞治療的客戶，進行干細胞培養的客戶，生產血清、胰酶、培養液的客戶，出售各種原代培養細胞系和腫瘤細胞系的客戶等），任選本公司生產的《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》、《發光法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》中的兩種進行檢測，將會得到比較滿意的結果。如果幾種不同支原體檢測方法的檢測結果一致，正確率幾乎就是100%。

試劑盒組成

（1）       探針法溶液1P：550 μL（50次），含支原體和內參檢測用引物及熒光探針;

（2）       探針法溶液2T：50 μL（50次），酶溶液;

（3）       內參質粒mycoIC2：500 μL;

（4）       去離子水：1.2 mL；

（5）       陽性支原體DNA：50 μL。

l  注1: 本試劑盒由于含有內參質粒mycoIC2（用于監控支原體DNA提取和qPCR擴增的有效性），客戶可以選擇進行樣品支原體DNA的提?。▋葏①|粒mycoIC2在支原體DNA提取過程中加入），也可以選擇不進行樣品支原體DNA的提?。▋葏①|粒mycoIC2直接加入樣品中）。

l  注2：客戶如果選擇進行樣品支原體DNA的提取，推薦使用本公司的《支原體基因組DNA提取試劑盒》（貨號： MG015）。該試劑盒的操作方法和試劑配方根據支原體的特點做了專門的優化和調整，其洗脫液與本公司的所有基于核酸擴增技術的支原體檢測試劑盒完全兼容【包括：《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》】。如果是其他公司DNA提取試劑盒的洗脫液，當反應體系中DNA量加大后（比如反應體系中DNA加入量由2 μL變為20 μL時）有可能會影響到核酸的PCR擴增效率。

l  注3：本試劑盒的配套儀器可以是任何具有FAM和VIC檢測通道的熒光定量PCR儀。需自備的試劑和耗材：熒光定量PCR八聯管、一次性手套、無DNAase的吸頭、無DNAase的離心管。

檢測過程

1.         待測樣品的前處理

為了準確判斷細胞是否有支原體的污染，待測的細胞培養液樣品需要取自換液后培養2-3天且匯合度在90%左右的細胞培養液上清（貼壁細胞）。懸浮培養的細胞也需要在換液傳代后，讓細胞生長2-3天再取培養液進行檢測?？梢园凑找韵聝煞N方法之一進行樣品的前處理：

方法一：對樣品進行支原體DNA的提取。

很多樣品（比如：培養很多天的細胞上清、血清、血漿等）由于含有抑制PCR擴增的成分，如果樣品不進行前處理而直接檢測，有可能導致qPCR擴增失?。?/span>qPCR結果：支原體通道和內參對照通道均無擴增曲線）。該類樣品建議客戶進行樣品DNA提?。ɑ蛘唠x心清洗，見后文方法二）后，再進行檢測。提取DNA的過程有兩個作用：（1）可以完全去除所有可能抑制PCR擴增的成分，保證后續定量PCR擴增的正常進行；（2）具有濃縮支原體DNA的作用，可以提高相對檢測靈敏度10-100倍。

樣品DNA的提取推薦使用本公司的《支原體基因組DNA提取試劑盒》（貨號： MG015）。

不同樣品支原體基因組DNA的提取步驟，請參考本公司的《支原體基因組DNA提取試劑盒》的說明書。

方法二：樣品不經DNA提取（推薦方法。該方法不僅可以濃縮支原體從而提高相對檢測靈敏度，還可以去除絕大部分可能的抑制物，PCR擴增被抑制的可能性極低。如果該簡單一步離心清洗的方法仍然無法去除抑制物，可以使用后文注意事項部分的三步離心清洗的方法。），具體方法如下：

（1）根據濃縮倍數，可以取100 - 1500 μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內，在普通臺式離心機上1000 rpm (大約150 g)低速離心5 minutes，將離心后的上清轉移到另一個離心管內，丟棄細胞沉淀。

（2）將上清繼續13000 rpm（約16000 g）高速離心5 minutes，小心吸走全部上清（為避免碰到底部沉淀，可以保留底部3-5 μL液體），用50μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8（樣品可以長期保存。推薦）或者去離子水（樣品比較不穩定，只適合當天或短期內檢測使用）重懸沉淀（沉淀中含有支原體），吹吸均勻【如果最初使用了1500 μL的樣品，則支原體濃度大約提高了30倍】。

（3）往50 μL重懸后的樣品中加入4 μL內參質粒mycoIC2【內參質粒融化后，請混勻后再吸取】。

（4）至此，該樣品可以直接進行檢測，也可以進行熱處理后再檢測（熱處理后，樣品保存更穩定）。熱處理具體如下：95 ℃加熱處理5 minutes（可以轉移到PCR管內，在PCR儀上進行加熱處理），簡單離心（1000 g，5 seconds）后，取上清進行檢測。

l  注1：這里的細胞培養上清不是指細胞經胰酶消化后的離心上清，而是指至少培養2天后的貼壁細胞培養液上清（不需要胰酶消化，也不能取經胰酶消化后的離心上清進行檢測）或懸浮細胞培養液。

l  注2：本步驟的低速離心是為了去除哺乳動物細胞，以排除其不必要的干擾。所以離心力要嚴格控制在150-200 g，該離心力下，哺乳動物細胞將被沉淀下來而支原體不會。如果錯誤使用更高的離心力將可能導致支原體也被離心下來，從而導致假陰性。

注3：收集的待測細胞培養液樣品如果不立即檢測，請放于-20℃或-80℃冰箱保存，不得放于室溫或4℃冰箱。樣品在-20℃至少可以保存一個月，在-80℃可以長期保存。此外，為了節約檢測成本，可以將不同時間收集的樣品放于-20℃或-80℃冰箱保存，而后一起檢測。

2.    熒光定量PCR體系的配制【本步驟所有操作強烈建議使用進口濾芯吸頭（比如Axygen濾芯吸頭）進行操作，以避免試劑被污染。操作之前，請認真看完后文的注意事項后，再進行操作】：

將探針法溶液1P、陽性支原體DNA、去離子水從-20 ℃冰箱中取出，放室溫融化（也可以用手握住幫助融化）。探針法溶液1P和探針法溶液2T開蓋之前，請高速離心一下（5000 rpm，離心1分鐘）。探針法溶液2T不能在室溫長久放置（可以短時間放置5-10分鐘），建議在-20 ℃冰箱直接吸取。

如果樣品總數為N（N=待測樣品數+1個陽性對照+1個陰性對照），qPCR反應體系分為樣品經DNA提取和不經DNA提取兩個不同反應體系，具體如下：

2.1樣品經《支原體基因組DNA提取試劑盒》進行DNA提取后的反應體系（注意：在DNA提取過程中，必須按說明書加入內參質粒mycoIC2）：

（1）           反應體系：

表1. 樣品經DNA提取后的反應體系

	單個樣品體積(μL)	樣品總數	總體積(μL)
探針法溶液1P	11	N	11×N×1.1
探針法溶液2T	1	N	1×N×1.1

l  注：總體積中多配制10%（該比例客戶如果覺得不合適，可以自己調整），是為了防止移液誤差，以保證每個反應管中的反應液足量。

l  舉例：如果待測樣品為8個（加上1個陰性和1個陽性對照），則樣品總數為10個。探針法溶液1P的總體積為11×10×1.1=121 μL，探針法溶液2T的總體積為1×10×1.1=11 μL。

（2）           將上述2種溶液混合，吹打均勻后，按每管12  μL分裝到熒光定量PCR八聯管中。

（3）           待測樣品管加入18 μL提取好的待測樣品DNA（樣品DNA加入量不能減少，否則內參質粒擴增可能失?。?；陰性對照管加入2 μL內參質粒mycoIC2（吹吸均勻后加入）和16 μL去離子水（為防止去離子水被污染，此處建議使用20 μL移液槍配合200 μL吸頭進行吸取操作）；陽性對照管加入2 μL陽性支原體DNA 和16 μL去離子水。每管反應液的總體積為30 μL。

l  注：裝有陽性支原體DNA的螺口管請不要高速離心，開蓋之前，只要用手指捏住，用力甩一下即可。吸取之前，請吹吸均勻后再吸取。如果不小心高速離心了，務必吹吸均勻后再吸取，否則陽性對照結果可能異常。

2.2樣品不經DNA提取的反應體系：

（1）         反應體系：

表2. 樣品不經DNA提取的反應體系

l  注：總體積中多配制6%（該比例客戶如果覺得不合適，可以自己調整），是為了防止移液誤差，以保證每個反應管中的反應液足量。

l  舉例：如果待測樣品為8個（加上1個陰性和1個陽性對照），則樣品總數為10個。去離子水的總體積為16×10×1.06=169.6 μL 探針法溶液1P的總體積為11×10×1.06=116.6 μL，探針法溶液2T的總體積為1×10×1.06=10.6 μL。

（2） 將上述3種溶液混合，吹打均勻后，按每管28  μL分裝到熒光定量PCR八聯管中。

（3） 待測樣品管加入2 μL未提取的待測樣品DNA，陰性對照管加入2 μL內參質粒mycoIC2（吹吸均勻后加入），陽性對照管加入2 μL陽性支原體DNA。每管反應液的總體積為30 μL。

l  注：裝有陽性支原體DNA的螺口管請不要高速離心，開蓋之前，只要用手指捏住，用力甩一下即可。吸取之前，請吹吸均勻后再吸取。如果不小心高速離心了，務必吹吸均勻后再吸取，否則陽性對照結果可能異常。

2.3 蓋上熒光定量PCR八聯管蓋子，去除反應管中的大氣泡，3000-6000 rpm離心30 sec。

l  注：定量PCR八聯管的封蓋，應該佩戴全新的一次性PE手套進行操作，避免裸手接觸定量PCR八聯管。

1.       實時熒光定量PCR擴增：

將PCR八聯管放入熒光定量PCR儀內，設置如下實時熒光定量PCR擴增程序：

表3. 熒光定量PCR擴增程序

l  注：支原體檢測熒光通道選擇FAM（Reporter: FAM，Quencher: None）；內參對照檢測熒光通道選擇VIC（Reporter: VIC, Quencher: None）；反應體積（Sample Volume）為30 μL；參考熒光（Passive Reference，只有ABI儀器需要設置）選擇None。

4.   結果分析：

4.1 ABI StepOne Plus 熒光定量PCR儀基線和閾值設定方法（注：其他熒光定量PCR儀的設置大同小異，請參考各自儀器說明書進行設置）：

（1）基線（Baseline）的設定：可以將Auto baseline前面的√ 去掉，然后手動設置基線的起點為2（將剛開始熒光值不穩定的幾個循環排除在基線之外。如果起點2不合適，可以適當增減），終點為10左右。

（2）閾值（Threshold）線的設定：不同通道的閾值應該分別設定。設定某個通道閾值線時，首先選中含陰性對照的若干個樣品，去掉儀器勾選的自動Threshold線，將其選項“√ Auto”改為“  Auto”，然后手動調整閾值線，以閾值線剛好超過正常陰性對照FAM通道擴增曲線（無規則噪音線）的最高點為準。

4.2 實驗有效性判斷：

陽性對照管：其FAM通道有典型的S型擴增曲線（即指數擴增），其VIC通道的擴增線呈直線或者S型曲線。

陰性對照管：其FAM通道的擴增線呈直線，其VIC通道應該有典型的S型擴增曲線。

如果陽性對照管、陰性對照管同時滿足上述條件，則說明本次實驗結果有效，否則實驗結果無效。

典型的陰性直線型擴增線和陽性S型擴增曲線如圖1所示：

組合       FAM通道（測支原體）    VIC通道（測內參）       支原體污染判斷

1                            S型曲線                                           S型曲線                    支原體污染

2                           S型曲線                                              直線                          支原體污染

3                              直線                                           S型曲線                           無支原體

4                              直線                                               直線                      PCR被抑制，結果無效

待測樣品管只要FAM通道有S型擴增曲線（組合1和組合2）就說明有支原體污染。因為外加的內參質粒mycoIC2分子數極少，如果支原體含量很大時，內參質粒的擴增會被徹底抑制，導致內參VIC通道無信號（組合2）。

如果待測樣品管FAM通道呈直線，而VIC通道有S型曲線（說明：樣品的DNA提取過程和PCR擴增過程均正常）（注：由于提取過程中，外加的內參質粒mycoIC2分子數極少，作為內參對照的VIC通道的Ct值會比較大），說明樣品無支原體。

如果陽性對照管和陰性對照管結果正常，而待測樣品管FAM通道和VIC通道均呈直線，說明PCR被抑制。如果樣品是經過提取的，最可能原因是：DNA洗脫前，吸附膜中的乙醇沒有揮發徹底（解決方法：洗脫前，將吸附柱放50-65℃烘箱至少15分鐘）。如果樣品是沒有經過提取的，則樣品本身含有抑制PCR的成分（解決方法：將樣品進行DNA提取或者離心清洗）。此外，二者相同的可能原因有（此種情況發生概率很低，一般不需要考慮）：內參質粒mycoIC2在運輸和儲存中有部分降解，導致回收或者加入的內參質粒mycoIC2分子偏少，導致內參VIC通道擴增失?。ń鉀Q方法：將內參質粒mycoIC2的加入量增加到原來的2-4倍）。

? 注1：陽性結果需要結合擴增曲線（主要）和Ct值（次要）進行判斷，不能只看Ct值（因熒光值的波動，個別陰性樣品雖然擴增曲線基本呈直線，但可能會出現Ct值，此類樣品不能判斷為陽性。反之亦然：有些樣品有S型曲線，但是因為熒光值波動，導致沒有Ct值，此類樣品不能判斷為陰性）。

? 注2： 結果判斷完后，將PCR八聯管用自封袋密閉后，進行適當處理。

注意事項

1. 實驗全過程，應該佩戴一次性手套操作。

2. 防DNA污染注意事項：

（1）強烈建議所有操作（特別是qPCR體系配制步驟和吸取試劑盒中試劑的時候）使用進口濾芯吸頭（比如：Axygen濾芯吸頭）進行操作，以免試劑被污染。如果沒有濾芯吸頭，至少應該使用新開封的吸頭。

（2）必須確保使用的移液槍本身沒有殘留的支原體。因此，最好使用全新購買的移液槍。如果沒有新購買的移液槍，至少應該使用以前沒有進行過細胞操作的移液槍。因為進行過細胞培養的移液槍極有可能被含支原體的培養液污染（如細胞培養時，不小心將含支原體污染的培養液吸入移液槍的槍體內）。由于本試劑盒非常靈敏，移液槍中吸附的支原體有可能造成不必要的假陽性。

（3）樣品前處理的各類吸頭、離心管，以及吸取陽性對照DNA、待測樣品DNA的吸頭，務必小心處理，請將其裝入含有半瓶水的帶蓋的、可密封的瓶子內，全部樣品吸取完后，蓋上瓶蓋，以防止陽性DNA的揮發，造成環境的污染，進而造成假陽性。

（4）整個操作過程，最好不要說話，因為人的口腔和唾液都是帶支原體的。

（5）反應后，請勿打開反應管的蓋子，否則有可能造成檢測環境的污染。結果判斷完后，將其用自封袋密閉后，進行適當處理。

3. 實驗室必須嚴格分房間操作（本試劑盒建議在有窗戶、通風良好的普通房間內操作，請勿在密閉的房間操作。請勿在細胞培養間進行該步驟的操作，因為細胞培養間支原體污染概率很高）：

? 試劑配制房間1：專門進行定量PCR體系的配制（建議該房間全部使用進口濾芯吸頭。）

? DNA提取房間2：專門進行支原體DNA的提??；

? DNA加樣房間3：專門進行定量PCR體系配制后，添加待測樣品、陽性對照、陰性對照等操作；

? PCR擴增房間4：進行實時熒光PCR擴增檢測。

注：如果房間緊張，可以考慮將房間2、房間3合并在一個房間，而房間1和房間4必須獨立。各房間物品（包括移液槍）均為專用，不得交叉使用。

4. 如果出現qPCR的擴增被細胞的代謝產物抑制時（qPCR結果：支原體通道和內參對照通道均無擴增曲線），可以采取以下幾種措施：

1) 將取樣的時間提前到換液后2天或3天，此時細胞上清的PCR擴增抑制物相對比較少，一般不會產生嚴重的抑制。據我們測試，換液后5天，PCR擴增抑制物就已經大量積累。

2) 用PBS對待測樣品進行離心清洗，去除樣品中的抑制物。具體方法如下：取1 mL細胞上清，先13000 rpm離心5 minutes，吸走950 μL上清；加PBS 950 μL，再次離心，吸走950 μL上清；再加PBS 950 μL，第三次離心，小心吸走全部上清（為避免碰到底部沉淀，可以保留底部3-5 μL液體），用50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重懸沉淀，95 ℃加熱處理5 minutes，簡單離心（1000 g，5 seconds）后，取上清進行檢測。但是該方法有如下缺點：第一，如果樣品支原體含量較少，離心清洗可能導致漏檢，因為離心清洗過程中，可能導致支原體部分丟失。第二，個別樣品，即使經過上述清洗也無法徹底去除抑制劑。

3) 使用支原體基因組DNA抽提試劑盒（推薦使用本公司《支原體基因組DNA提取試劑盒》），抽提細胞上清的支原體DNA后再進行PCR鑒定。

4) 使用本公司生產的《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》或者《發光法支原體檢測試劑盒》進行檢測，經測試，未發現這兩種試劑盒會被細胞的代謝產物所抑制。

為了預防PCR的擴增被細胞的代謝產物抑制的問題，也可以考慮將所有待測樣品全部進行離心清洗或者DNA提取后，再使用本試劑盒進行檢測。

5. 支原體檢測樣品可以分成兩類：第一類，用含血清的培養液培養的哺乳動物細胞上清液，由于該條件非常適合支原體生長，培養數天后，支原體密度一般較高，可達107-9/mL，可以直接檢測。第二類，低溫保存的血漿、血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養液等樣品，由于這些樣品即使有支原體污染，支原體含量一般很少，直接使用快速支原體檢測試劑盒進行檢測，往往檢測不出來。這些樣品建議：（1）對樣品的支原體進行離心濃縮或者使用本公司《支原體基因組DNA提取試劑盒》將支原體DNA濃縮提取，該兩種方法大約可以將檢測靈敏度繼續提高10-100倍。該方法速度快，當天出結果，但是可靠性不如后面的培養法。（2）使用支原體液體培養基（必須同時接種不含精氨酸和含精氨酸的兩種支原體液體培養基）培養3-7天后，再進行檢測。具體方法請參考本公司《發光法支原體檢測試劑盒》說明書中最后的注意事項部分。該方法速度較慢，需要3-7天，但是可靠性高。

6. 如何提高本試劑盒檢測靈敏度：如果預期待測樣品支原體含量較少（比如，低溫保存的血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養液、生物制品、極個別細胞培養上清等），可以采取以下幾種措施：（1）通過使用本公司《支原體基因組DNA提取試劑盒》，將支原體DNA濃縮提取后再進行檢測（提取過程還可以把所有可能的PCR抑制劑全部去除），大約可以將檢測靈敏度提高10-100倍。（2）對支原體進行離心濃縮：取1 mL細胞上清，先13000 rpm（約16000 g）離心5 minutes，吸走全部上清，用50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重懸沉淀，95 ℃加熱處理5 minutes，簡單離心后（1000 g，5 seconds），取上清進行檢測。該離心濃縮過程大約可以將檢測靈敏度提高20倍。（3）如果樣品是未經提取的，可以通過增加反應管中樣品DNA的加入量，比如由原來的2 μL增加到18 μL，如此可以提高檢測靈敏度9倍【注意：（A）沒有提取純化或者離心清洗的待測樣品，不能直接擴大待測樣品體積，否則PCR被抑制的可能性將大幅度增加；（B）如果確定要增加每個反應管中樣品DNA的加入量，樣品中內參質粒的加入量要成比例減少。比如原來樣品DNA的加入量為2 μL ，則50 μL樣品中需要加入4 μL內參質粒；如果改變后樣品DNA的加入量為16 μL（原來8倍），則50 μL樣品中只需加入0.5 μL內參質粒（原來1/8），以保持每個反應管中內參質粒的總加入分子數不變】。

7. 如發現細胞被支原體污染，本公司提供細胞專用支原體清除和預防試劑，以及水浴專用殺菌劑和環境專用殺菌劑。

8. 本試劑盒與Sigma公司的Lookout Mycoplasma qPCR Detection Kit（貨號：MP0040A）原理一樣，可以替代后者用于細胞培養上清的支原體檢測。

?《探針法支原體檢測試劑盒》靈敏度測試

我們選取了上述20種支原體中比較有代表性的4種支原體（分別是：A. laidlawii，M. pneumoniae，M. fermentans和M. orale），使用含相應支原體基因片段的質粒載體，經DNA定量后，計算出相應的分子數。

質粒經10倍系列稀釋【從10^(-4)到10^(-11)】后，進行相應的qPCR擴增（每個稀釋度做2個重復），其結果如下表所示：

?    說明：各支原體質粒10倍系列稀釋的Ct值。每個稀釋度做2個重復，每個反應管的DNA加入量為2μL。由表1可知：在每個反應管的DNA加入量為2μL的情況下，《探針法支原體檢測試劑盒》對4種支原體的最高檢測靈敏度（即檢測下限）大約在4-16 copies，即2-8 copies/μL【具體請參考表1中，4種支原體質粒的10^(-10)稀釋度的數據】。

    注：《探針法支原體檢測試劑盒》檢測靈敏度詳細數據，請參考其方法學報告。