?上海易色醫療科技有限公司
Shanghai Yise Medical Technology Co.,Ltd.
《支原體基因組DNA提取試劑盒》（離心柱法）說明書（版本20201218）
【PDF版本說明書，請到本網站 下載中心 頁面下載！】
貨號
?MG015
包裝規格50次/盒
儲存條件
該產品常溫運輸，室溫保存（收貨后，其中的Proteinase K放-20?C保存）。該條件下，至少3年內有效。Proteinase K溶液可以在室溫保存6-12個月，長期保存需要放-20?C。
產品簡介
《支原體基因組DNA提取試劑盒》（離心柱法）（Mycoplasma Genomic DNA Extraction Kit with Columns）的操作方法和試劑配方已經針對支原體的特點做了優化，專門用于從體外培養的細胞、細胞上清、血清、血漿、全血、生物制品等樣品中提取支原體基因組DNA。提取的支原體基因組DNA可用于《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》。
支原體基因組DNA的提取有兩個作用：（1）可以去除所有可能抑制PCR擴增的成分或者干擾《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》顯色的成分，保證后續PCR擴增的正常進行或者《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》的顯色不被干擾；（2）具有濃縮支原體DNA的作用，可以提高相對檢測靈敏度10-100倍。
產品組份（50次）
蛋白酶K溶液：Proteinase K(20 mg/mL）
溶液GR：Buffer GR， 15 mL
溶液GL：Buffer GL， 15 mL
清洗液GW1：Buffer GW1(Concentrate)， 13 mL
清洗液GW2：Buffer GW2(Concentrate)， 15 mL
洗脫液EB：Elution Buffer EB， 15 mL
吸附柱：Spin Columns DM， 50個
收集管：Collection Tube， 50個
需自備的試劑和耗材：（1）無水乙醇；（2）1.5 mL離心管
操作步驟
1. 實驗前準備及重要注意事項
1) Buffer GW1和Buffer GW2的配制：第一次使用前，應按照試劑瓶標簽的說明先在Buffer GW1和Buffer GW2中加入無水乙醇，并在試劑瓶標簽中做好標記。
2) 使用前請檢查Buffer GL是否出現結晶或者沉淀，如有結晶或者沉淀，請將Buffer GL于56?C水浴孵育重新溶解。
2. 樣品處理：本試劑盒優選體外培養的細胞上清（貼壁細胞直接取細胞培養上清、懸浮培養細胞取低速離心后的離心上清）、血清、血漿、溶液型生物制品作為提取支原體基因組DNA的樣品。如果是粉末型樣品，需用水溶解后，再進行后續操作。
? 注1：體外培養的貼壁細胞培養上清或懸浮細胞，經1200 rpm（約150 g）低速離心5分鐘后（切記：此步驟離心力不能太大，否則支原體會被離心去除了?。?，取離心后上清進行檢測。
? 注2：如果初始樣品是加了抗凝劑的全血，經1200 rpm（約150 g）低速離心10分鐘后（切記：此步驟離心力不能太大，否則支原體會被離心去除了?。?，取上層血漿進行檢測。也可以不經過低速離心，直接取200 μL全血進行后續操作。
? 注3：如果初始樣品是未加抗凝劑的全血，待血液凝固后，取血清進行檢測。
3. 取上述細胞上清、血清、血漿、生物制品等樣品200 μL，用移液槍吹吸均勻后，進行后續操作。
? 注1：當樣品量小于200 μL時，加入Buffer GR補足至200 μl，再進行下一步實驗。
? 注2：如果預期待測樣品支原體含量較少（比如長期低溫保存的血清、血漿、胰酶、生物制品等），可以取上述樣品1 mL，加入1.5 mL離心管內，13000 rpm（約16000 g）高速離心 5 分鐘。吸走離心后的上清800 μL，剩余200 μL用移液槍吹吸均勻后，進行后續操作。此步驟起濃縮支原體的作用，從而提高支原體檢測的相對靈敏度。如果需要，上述樣品的體積可以進一步放大，經過多次高速離心后，剩余200 μL用于后續操作（比如，如果初始體積是5 mL，經5次高速離心，取剩余的200 μL進行后續操作，最終用50 μL 洗脫液進行洗脫，則支原體DNA大約濃縮了100倍，支原體檢測的相對靈敏度也大約提高了100倍。）
4. 向以上溶液中加入20 μL Proteinase K（20 mg/mL）溶液，混勻。
5. 加入200 μL Buffer GL（如果室溫較低，使用前請檢查Buffer GL是否出現結晶或者沉淀，如有結晶或者沉淀，請將Buffer GL于56?C水浴孵育重新溶解），用吸頭充分吹吸均勻或用Vortex充分震蕩。
? 注意：不要將Proteinase K和Buffer GL進行預混，否則Proteinase K可能失活。
6. 將離心管放置56?C水浴，孵育15分鐘。
? 注意：此步驟不能省略！
7. 加入2 μL支原體qPCR內參質粒mycoIC2（注意：內參質粒mycoIC2請吹吸均勻后，再加入。內參質粒mycoIC2只在本公司《探針法支原體檢測試劑盒》內含有，如果使用其他支原體檢測方法，本步驟可以跳過?。?。
? 注1：此步驟只有使用本公司《探針法支原體檢測試劑盒》時，需要加入支原體qPCR內參質粒mycoIC2。
? 注2：加入的內參質粒mycoIC2用于監控支原體DNA的提取和后續支原體qPCR的擴增是否有效。
8. 加入200 μL無水乙醇，上下顛倒混勻數次。
? 注意：此處不能高速離心！如果需要（一般不需要離心），只能1000 rpm（約100 g）低速短暫離心（20 Sec），使管壁和壁蓋上的液體集中到管底。
9. 用1 mL吸頭將所得溶液全部（含管壁和蓋子上溶液）加入到已裝入收集管的吸附柱(Spin Columns DM）中。12,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
10. 向吸附柱中加入500 μL Buffer GW1（使用前檢查是否加入無水乙醇!）,蓋上蓋子，將吸附柱快速顛倒一次（目的：清洗管壁和蓋子中的雜質），12,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
11. 向吸附柱中加入500 μL Buffer GW2（使用前檢查是否加入無水乙醇!），蓋上蓋子，將吸附柱快速顛倒一次（目的：清洗管壁和蓋子中的雜質），12,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
12. 再次清洗：向吸附柱中加入600 μL Buffer GW2（使用前檢查是否加入無水乙醇!），蓋上蓋子，將吸附柱快速顛倒一次（目的：清洗管壁和蓋子中的雜質），12,000 rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
13. 繼續12,000 rpm離心2分鐘。離心后，在亮光下，仔細檢查吸附柱內部吸附膜上方的塑料墊圈四周是否有液體殘留。如果發現吸附柱內部塑料墊圈四周有液體殘留，可以將吸附柱放回收集管內，將有液體殘留的一側放在離心力內側，繼續12,000 rpm離心1分鐘。
14. 離心后，經仔細檢查，如果確認吸附柱內部塑料墊圈四周沒有液體殘留，則可以丟棄收集管，將吸附柱置于一個新的1.5 mL離心管（自備）中，打開吸附柱蓋子，置于50-65℃的烘箱內放置至少15分鐘，以讓吸附膜中的乙醇徹底揮發干凈（請務必放在50-65℃的烘箱內放置！如果室溫放置，不僅時間需要延長，還不排除有些樣品由于乙醇揮發不干凈，影響后續PCR擴增效率，甚至徹底失敗）。
? 注意：打開吸附柱蓋子，將吸附柱放在50-65℃的烘箱內至少15分鐘，此步驟非常關鍵！如果沒有烘箱，強烈建議購買一個。這一步的目的是將吸附膜中殘余的乙醇徹底去除，乙醇的殘留會嚴重影響后續的酶促反應（如：酶切、PCR擴增等），甚至可能導致后續的PCR徹底失敗。
15. 向吸附柱的中間部位懸空加入50 μL Elution Buffer EB，室溫放置3分鐘，12,000 rpm離心1分鐘，收集DNA溶液，-20℃保存。
? 注1：本公司的Elution Buffer EB是經過優化的洗脫液，該洗脫液與本公司的所有基于核酸擴增技術的支原體檢測試劑盒完全兼容（包括：一步法恒溫支原體檢測試劑盒，PCR法支原體檢測試劑盒和探針法支原體檢測試劑盒）。如果是其他公司DNA提取試劑盒的洗脫液，當反應體系中樣品DNA量加大后（比如反應體系中DNA加入量由2 μL變為20 μL時）有可能會影響到核酸的擴增效率。
? 注2：如果樣品的初始體積分別是200 μL、1 mL或5 mL，經最后50 μL洗脫，則支原體DNA分別大約濃縮了4倍、20倍或100倍，支原體檢測的相對靈敏度也大約提高了4倍、20倍或100倍。