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《發光法支原體檢測試劑盒》?產品重要信息

（2）產品說明書： PDF版說明書，請到本公司網站“下載中心”頁面下載！

《發光法支原體檢測試劑盒》說明書（版本20210205）

【本說明書會不定期更新，每次收到新的產品時，請到本公司網站重新下載最新版本！】

貨號

LM009

包裝規格

50次/盒

儲存條件

產品為凍干品，隨干冰或冰袋運輸，收到產品后，溶解之前，請放-80 ℃冰箱低溫保存。該條件下，至少可以保存5年。溶解之前，放-20 ℃冰箱，可以短期保存1-2個月。有條件，請盡量放-80 ℃冰箱保存。

當凍干品溶解后，在冰上操作，按每管50 μL分裝到1.5 mL離心管中，分裝后，立即在-80 ℃冰箱低溫保存。該條件下，至少可以保存3年。注意：凍干品溶解后不能放-20 ℃保存！

產品用途

《發光法支原體檢測試劑盒》（Luminescence Mycoplasma Detection Kit）可用于檢測體外培養的哺乳動物細胞或者其他樣品是否被支原體污染。

產品簡介

哺乳動物細胞的培養，支原體（Mycoplasma）污染是個世界性的問題。支原體污染幾乎可以改變細胞的所有參數，導致實驗結果的不準確、甚至完全錯誤（支原體污染對細胞的詳細危害，請參考本公司的網站：www.stylediaryblog.com）。從2013年開始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及細胞培養都要進行支原體檢測。相信會有越來越多的高水平期刊將做出同樣的支原體檢測要求。

培養法是相對可靠的支原體檢測技術，但是該方法非常耗時的，需要數周，不適合作為細胞培養液中支原體污染的快速檢測。此外，通過固體培養法無法檢測污染細胞的一種最常見的支原體，即豬鼻支原體（M.Hyorhinis）。這是因為豬鼻支原體無法在支原體固體培養基上形成可見的菌落。而豬鼻支原體約占所有支原體污染的20-50%。

有的實驗室使用熒光染色法檢測支原體，但是該方法靈敏度太低，而且嚴重依賴實驗人員的經驗，實驗的穩定性極差。此外，當該方法檢測成陽性時，細胞經常已經嚴重污染。

培養法和熒光染色法雖然是我國藥典收錄的支原體檢測方法，但是因為其各自都有明顯的缺點，不適合作為支原體快速檢測的方法。

本公司目前已經開發出四種不同原理的快速支原體檢測試劑盒，分別是：《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》、《發光法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》，其各自都有自己的優缺點（詳情請參考本公司網站）。

《發光法支原體檢測試劑盒》具有檢測時間短、支原體識別率高、可以檢測活的支原體、不存在因反應被抑制導致的假陰性、不存在污染導致的假陽性等優點。

《發光法支原體檢測試劑盒》主要缺點：支原體必須經過繁殖后才能檢測。

《發光法支原體檢測試劑盒》檢測靈敏度：經測試，在每個反應孔的活菌加入量為50μL的情況下，《發光法支原體檢測試劑盒》的檢測下限（即需要樣品的發光值與陰性對照的發光值的比值大于1.2）大約為2200個活菌/μL?？梢酝ㄟ^離心濃縮，其檢測靈敏度可以在此基礎上繼續提高至少10倍。

此外，作為支原體檢測領域的共識，單獨使用任何一種支原體檢測方法，都無法做到100%正確，既不會漏檢（假陰性），也不會多檢（假陽性）。嚴格的支原體檢測，至少需要使用兩種（最好使用三種）不同原理的支原體檢測方法同時進行檢測，才能使檢測結果接近100%正確。

如果您想得到100%正確的支原體檢測結果（比如，開展細胞治療的客戶，進行干細胞培養的客戶，生產血清、胰酶、培養液的客戶，出售各種原代培養細胞系和腫瘤細胞系的客戶等），任選本公司生產的《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》、《發光法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》中的兩種進行檢測，將會得到比較滿意的結果。如果幾種不同支原體檢測方法的檢測結果一致，正確率幾乎就是100%。

產品原理

《發光法支原體檢測試劑盒》通過檢測支原體含有的特異性ATP合成相關酶的活性以達到檢測體外培養的哺乳動物細胞是否被支原體污染的目的。

在支原體裂解后，該支原體特異性的酶，在底物存在下，具有將ADP轉化成ATP的功能。由于熒光素酶（Luciferase）催化底物熒光素（Luciferin）產生光的反應需要ATP的參與，支原體特異性酶催化產生的ATP含量，可以通過該反應轉化成生物發光（Bioluminescence）信號，該信號可以使用專門的發光檢測儀（Luminometer）或具有發光檢測功能的多功能酶標儀進行檢測，發光的強度與ATP的含量成正比。具體的反應如下：

通過比較細胞培養上清和未用于細胞培養而成分完全相同的培養液二者的支原體特異性酶的含量，即可知道培養的細胞是否被支原體污染。

產品優點

《發光法支原體檢測試劑盒》具有如下顯著的優點：

1.         檢測時間短。整個檢測過程只需30分鐘左右。

2.         《發光法支原體檢測試劑盒》檢測的是活支原體，只有樣品中存在活的支原體，才會生產陽性結果，可以區分支原體的死活。而《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》都是檢測支原體的DNA，不論支原體的死活，樣品中只要有支原體DNA的存在，就會生產陽性結果，所以無法區分支原體的死活。細胞培養中，最關心的是細胞培養液上清或者血清、胰酶等成分中，是否有活的支原體。而如果僅有死的支原體或者一些殘存的支原體DNA，是無關緊要的。

3.         不存在假陽性。由于《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》都需要對支原體DNA進行大量的擴增，檢測過程中，只要有微量的支原體DNA或者擴增產物的污染，就會出現假陽性。而《發光法支原體檢測試劑盒》只檢測活的支原體，不存在擴增產物污染樣品的問題。

4.         不存在因反應被抑制導致的假陰性。由于細胞培養數天后，培養液中經常含有嚴重抑制PCR擴增的代謝物，所以使用《PCR法支原體檢測試劑盒》經常會出現假陰性的問題。該問題在《發光法支原體檢測試劑盒》不存在。

5.         《發光法支原體檢測試劑盒》對支原體的識別率極高：由于本試劑盒依賴的支原體特異性酶普遍存在，其具有廣譜的識別能力。

試劑盒組成

（1）       支原體檢測溶液：5.5 mL

（2）       試劑A(已凍干)：2.5 mL（50次檢測）

（3）       試劑B(已凍干):  2.5 mL（50次檢測）

l  注意：本試劑盒不含陽性對照，發光法陽性對照需要單獨購買（貨號：LPC10）。

檢測過程

1.         檢測試劑的分裝和保存

收到的產品為凍干品，溶解前，請放-80 ℃冰箱低溫保存。第一次使用前，在冰上操作，分別用2.5 mL支原體檢測溶液溶解試劑A和試劑B（注意：因為試劑A和試劑B的離心管容量不足2.5 mL，可以分別先用1 mL支原體檢測溶液將凍干的試劑A和試劑B溶解后，轉移到一個5 mL或10 mL的離心管中，再各補加1.5 mL支原體檢測溶液）, 按每管50 μL分別分裝到50個1.5 mL離心管中，立即放-80 ℃冰箱低溫保存。

2.         陰性對照的設置

本試劑盒每次檢測都必須設置陰性對照。陰性對照必須使用配制完后放于4℃冰箱，未用于細胞培養但成分完全相同的培養液，包括其中的血清、抗生素等含量也必須完全相同。特別是其中的血清含量和批次，對發光的本底值影響很大，作為陰性對照的培養液，其中添加的血清，必須與用于細胞培養的血清批次相同且含量完全相同。例如：如果用于細胞培養的培養液為含有10%的胎牛血清的高糖DMEM，那么陰性對照也應該使用含有相同批次的10%的胎牛血清的高糖DMEM。如果用于細胞培養的培養液為無血清培養液，那么陰性對照也應該使用無血清但成分相同的培養液。

上述陰性對照的選取是按照最嚴格的方式進行的。如果確實沒有成分完全相同的培養液，也可以使用成分最接近的培養液作為陰性對照。如果有些樣品實在沒有合適的陰性對照或者不知道樣品原來的培養基組成，可以嘗試使用含10%血清的DMEM培養基作為陰性對照。

3.         陽性對照的設置

如果您實驗室擁有經其他支原體檢測方法（比如本公司的《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》或者《PCR法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》等）檢測為陽性的細胞系，其培養3天后的上清即可以直接按照后文的樣品準備方法，自己制備陽性對照。

如果您沒有上述陽性樣品，那么陽性對照也可以從我們公司單獨購買（貨號：LPC10）。如果第一次使用《發光法支原體檢測試劑盒》，建議購買一支本公司的《發光法支原體檢測試劑盒陽性對照》。

4.         待測樣品的準備

為了準確判斷細胞是否有支原體的污染，待測的細胞培養液樣品最好來源于至少培養2-3天且匯合度在70-90%左右的細胞培養液上清（貼壁細胞）。懸浮培養的細胞也需要在換液傳代后，至少讓細胞生長2-3天再取培養液進行檢測。具體操作如下（請嚴格按照相應的體積進行操作）：

（1）根據濃縮倍數，可以取180-1500 μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內，在普通臺式離心機上1000 rpm (大約150 g)低速離心5 minutes，將離心后的上清轉移到另一個離心管內（注意：轉移離心上清時，請保留底部60 μL左右的液體，以防止將底部細胞沉淀吸走！），丟棄含細胞沉淀的原有離心管。

l  注意1：本步驟為樣品檢測之前必不可少的步驟，低速離心是為了去除哺乳動物細胞，以排除其對支原體檢測的干擾。所以離心力要嚴格控制在150 g左右，該離心力下，哺乳動物細胞將被沉淀下來而支原體不會。如果錯誤使用更高的離心力將可能導致支原體也被離心下來，可能導致假陰性。而如果錯誤使用更低的離心力將可能導致哺乳動物細胞不能被離心沉淀下來，從而導致支原體檢測時，哺乳動物細胞內的ATP也被釋放到溶液中，可能導致假陽性。

l  注意2：如果初始體積是1500 μL，大約可以將支原體濃度提高10倍，從而提高檢測的相對靈敏度10倍（如有必要，可以繼續增加樣品的初始體積，從而進一步提高檢測相對靈敏度）。

（2）將含有上清的新的1.5 mL離心管，在普通臺式離心機上16000 g （大約13000 rpm）高速離心5分鐘，沿離心管內壁離心時的內側面將離心后的上清小心緩慢全部吸走并丟棄（注意：勿讓吸頭碰到離心管內壁的底部外側，因為底部外側可能含有支原體的沉淀?。?。往離心管內，加入120 μL作為陰性對照的培養液。

（3）將上述經過離心清洗一次的樣品， 再次在普通臺式離心機上16000 g （大約13000 rpm）高速離心5分鐘【離心時注意保持離心管放置的方向與上述步驟（2）相同】，同樣小心吸走115 μL離心后的上清并丟棄（注意：同樣勿讓吸頭碰到離心管內壁的底部外側。留下大約5 μL培養液的目的也是為了防止吸頭碰到離心管底部外側而將可能含有支原體的沉淀吸走）。往離心管內，加入115 μL作為陰性對照的培養液（此時，總體積仍然為120 μL）。

（4）將上述經過離心清洗兩次的樣品，用移液槍上下吹吸10-20次，將可能含有支原體的沉淀吹打均勻。至此，該樣品方可用于后續的支原體檢測（夠兩次檢測使用）。

l  注意：（2）-（4）步驟也是樣品檢測之前必不可少的步驟，高速離心是為了將支原體沉淀下來，而將培養液替換成陰性對照的培養液是為了排除一些細胞代謝產物對后續檢測的可能干擾。

5.         待測樣品的保存

收集并經過低速離心去除細胞和經過高速離心替換成陰性對照培養液的待測樣品，最好當天檢測完畢。如果不是當天立即檢測，請放于-80℃冰箱保存，不得放于室溫、4 ℃或-20 ℃冰箱。樣品在-80℃可以保存至少2年。

l  注意：（1）為了日后檢測方便，應該同時凍存一些作為陰性對照的培養液。（2）未經過低速離心去除細胞和未經過高速離心替換成陰性對照培養液的待測樣品，不得直接放-80℃冰箱保存。（3）經我們最新測試表明，經過低速離心去除細胞的樣品即可直接放-80℃冰箱保存，后續高速離心替換成陰性對照培養液的步驟，可以在發光檢測時，從-80℃冰箱取出融化后統一進行。

6.         在制備好上述待測樣品、陰性對照和陽性對照后，根據待檢測的樣品、陰性對照和陽性對照的數量，從-80 ℃冰箱取出相應數量的試劑A和試劑B，放冰上，待其融化后使用（注意：不能加熱融化）。

l  注意：試劑A和試劑B只能在每次檢測之前從-80 ℃冰箱取出的，只能在冰上融化。融化后，放冰上的時間不得超過1小時【注意：融化后的試劑A和試劑B最好立即使用，融化后冰上放置的時間越長，發光讀值可能就越低】。已經融化后的試劑A和試劑B不能再次凍存使用。

7.         吸取50 μL陰性對照、陽性對照或者已經經過低速離心去除細胞和經過高速離心替換成陰性對照的培養液的待測樣品，放入黑色（優先選擇）或者白色不透明的96孔板內，加入50 μL冰上放置的試劑A，室溫反應15分鐘。

l  注：不能使用透明的96孔板，否則孔與孔之間的發光值會互相干擾。

8.         室溫反應15分鐘后，加入50 μL冰上放置的試劑B，無需等待，立即在具有發光檢測功能的多功能酶標儀或者單獨的發光檢測儀（Luminometer）上，以儀器默認的螢火蟲熒光素酶（Luciferase）的發光檢測參數進行發光值的檢測，5分鐘內，連續測5次陰性對照和待測樣品的發光值，計算各自的平均值。

l  注意1：發光檢測（Luminescence）與熒光檢測（Fluorescence）、吸收光檢測（Absorbtance）是不同的功能。吸收光檢測即最常用的OD值檢測。熒光檢測（比如常見的FITC檢測）需要激發光，而發光檢測（如熒光素酶的活性檢測）不需要激發光。多功能酶標儀常見的檢測功能有：吸收光檢測、熒光檢測和發光檢測，三種功能為獨立的功能。您如果不清楚您實驗室的酶標儀是否具有發光檢測功能，請咨詢您的實驗室主任或者酶標儀廠家。

l  注意2：發光檢測時，應該選擇不加載任何濾光片（不同酶標儀表達方式不一樣，可能是：Unfiltered LUM、All wavelengths或Open hole）進行檢測【此時讀值較高】或者使用螢火蟲熒光素酶（Luciferase）最強的發光波長560 nm進行檢測【此時讀值較低】；

l  注意3：可以通過調節酶標儀的檢測靈敏度（Sensitivity）或延長發光檢測的時間（Integration time， Measurement time），盡量讓陰性對照的發光值大于1000；

l  注意4：如果樣品是無血清細胞培養上清，相應的陰性對照培養基因不含血清，其發光值可能會比較低，甚至只有100左右的發光值，此時可以在陰性對照培養基中加入10%的胎牛血清或小牛血清，當然無血清細胞上清樣品也必須用含10%的胎牛血清或小牛血清的陰性對照培養基進行替換（高速離心后替換，見上述步驟4）后，再進行檢測。加入血清后一般可以明顯提高陰性對照的發光值。

 

結果判斷

計算待測樣品的發光平均值與陰性對照的發光平均值的比值：

1.         如果比值>1.2，說明待測樣品有支原體污染（陽性）。絕大部分陽性樣品，該比值都在1.5以上。嚴重的污染，該比值甚至可以達到10以上。

2.         如果比值在1.1-1.2之間，說明待測樣品可疑有支原體污染（可疑陽性）。但該樣品需要繼續培養24-48小時后，重新檢測。如果繼續培養24-48小時后，重新檢測的比值仍然在1.1-1.2之間，應該判為陰性。

3.         如果比值<1.1，說明待測樣品無支原體污染（陰性）。

l  注意1：以上比值只是一個經驗值，如果同一個樣品的5次發光值讀數之間的差異小于10%，上述比值與污染之間的對應關系一般是正確的。如果同一個樣品的5次發光值讀數之間的差異大于10%，上述比值與污染之間的對應關系就未必正確。這時，比值接近檢測下限的樣品，就需要根據具體情況來確定是陰性還是陽性。

l  注意2：新的實驗室初期建立該方法時，應該同時使用不同原理的支原體檢測試劑盒進行相互確認【我們推薦使用含內參對照的PCR法支原體檢測試劑盒（比如我們公司的PM008）或者我們公司的《探針法支原體檢測試劑盒》】。?

注意事項

1、  本試劑盒只在96孔板進行過測試。因為發光值會隨時間略有變化，如果使用單管的發光檢測儀，盡量保證陰性對照和待測樣品加入試劑A后的反應時間和加入試劑B后到發光值檢測的反應時間相同。

2、  問：如果配制完后放于4℃冰箱未用于細胞培養且成分完全相同的培養液本身有支原體污染（比如加入的血清本身含支原體），是否仍然可以用作陰性對照？

答：可以。因為：即使作為陰性對照的培養液本身有支原體污染，其中的含量也是極其微量的。而待測樣品是經過培養3天以上的，其支原體在這3天培養過程中，會大量繁殖，用《發光法支原體檢測試劑盒》檢測的發光值，肯定比陰性對照的發光值高得多。

3、  本試劑盒與Lonza公司的MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit的原理一樣，可以替代后者用于細胞培養上清的支原體檢測。

4、  如發現細胞被支原體污染，本公司提供細胞專用支原體清除和預防試劑，以及水浴專用殺菌劑和環境專用殺菌劑。

 

附錄：如何檢測血清是否含有支原體污染？

 

血清有沒有支原體污染這是細胞培養用戶非常關心的問題。其檢測方法有相當的特殊性，現介紹如下：

1.     必須認識到血清不適合直接檢測，在對其進行檢測之前，必須將其中可能含有的支原體進行大量的繁殖。這是因為：商品化的血清都是經過0.1 μm的濾膜多次過濾的而且長期低溫保存和運輸，其中即使含有支原體，其含量也必然是極其微量的（比如1 mL就含有幾個支原體），直接檢測一般是檢測不出來的?！驹擃悩悠?/span>折中的方法是：對樣品的支原體進行離心濃縮或者使用本公司《支原體基因組DNA提取試劑盒》將支原體DNA濃縮提取，該兩種方法大約可以將檢測靈敏度繼續提高10-100倍。該方法速度快，當天出結果，但是可靠性不如培養法。】

2.     血清樣品中支原體的繁殖方法：分別取1 mL的血清，按1:10稀釋到2種不同的支原體液體培養基（其中一種不含精氨酸，另外一種含精氨酸）中【注意：（1）因為每種支原體的營養需求不一樣，2種支原體液體培養基都必須同時接種和培養；（2）血清接種的量不能太小，一般接種不少于1 mL，否則可能漏檢；（3）不能使用常規的哺乳動物細胞培養液代替支原體液體培養基。因為經我們測試：在沒有動物細胞共培養的情況下，支原體在含10%血清的動物細胞培養液如DMEM、1640、 MEM、GMEM中繁殖非常緩慢，甚至完全不繁殖?！?，然后部分放4 ℃冰箱，部分放37 ℃二氧化碳培養箱或者普通的細菌培養箱中培養3-7天【對于生長速度快的支原體，3天的培養已經足夠；對于生長速度慢的支原體，培養的時間可以適當延長】。3-7天后，進行支原體的檢測【建議培養3天和7天后各檢測一次】。

3.     培養3-7天后的樣品中支原體的檢測方法，可以在本公司《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》、《發光法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》中任選1-3種進行檢測。由于，血清是否含有支原體，事關重大，我們建議至少同時使用兩種（最好使用三種）方法進行檢測（其中一種我們推薦使用含內參對照的《PCR法支原體檢測試劑盒》或者選擇《探針法支原體檢測試劑盒》，因為只有這兩種試劑盒支原體識別率達到100%）。

4.     如果選擇《發光法支原體檢測試劑盒》進行檢測，具體操作如下：以放4 ℃冰箱的含10%待測血清的支原體液體培養基作為陰性對照，用《發光法支原體檢測試劑盒》檢測培養箱中培養3天的培養液，其發光值是否明顯增高，從而判斷最初加入的血清是否含支原體。

5.     當然，培養3-7天后的樣品，也可以用《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》或《探針法支原體檢測試劑盒》進行檢測。用這即種方法進行檢測時，建議同時檢測原液和1:10的稀釋液，稀釋液用PBS。這是因為：（1）原液仍然含有10%的血清，其仍然有可能抑制PCR的擴增；（2）一個樣品同時檢測兩個稀釋度，對于結果判斷的準確性非常有幫助。結果判斷如下：（1）如果兩個稀釋度的檢測結果都為陰性，說明血清沒有支原體污染；（2）兩個稀釋度的檢測結果只要一個為陽性，說明血清有支原體污染，而且極有可能是污染了活支原體。最常見的結果是兩個稀釋度都為陽性或兩個稀釋度都為陰性。

6.     本公司同時提供2種支原體液體培養基（干粉型）產品，其中一種不含精氨酸，另外一種含精氨酸。大家購買后，自己按說明書配成支原體液體培養基，其中的馬血清可以不加，而用待測的胎牛血清代替（終濃度10%即可）。其中的青霉素可以不用添加或者用細胞培養用的青霉素和鏈霉素（100×，按1:100加入）代替。1瓶支原體液體培養基（干粉型）大約可以檢測1000個血清樣品。

7.     如果大家覺得上述檢測非常繁瑣，本公司同時供應經上述步驟嚴格檢測，證明100%不含活支原體的精選進口胎牛血清。

其他：如何檢測胰酶、抗生素、未使用的動物細胞培養液等細胞培養相關試劑是否含有支原體污染？

這些樣品也不適合直接檢測。方法與血清的檢測方法非常類似，在對其進行檢測之前，也必須將其中可能含有的支原體進行大量的繁殖。首選，必須先檢測支原體液體培養基中含有的血清是否被支原體污染，在保證血清沒有支原體污染的前提下，配制含10%經證明沒有支原體污染的血清的支原體液體培養基，然后將不少于1 mL的胰酶、抗生素或者動物細胞培養液等按1:10稀釋到該培養基中，然后部分放4 ℃冰箱，部分放37 ℃二氧化碳培養箱或者普通的細菌培養箱中培養3-7天，3-7天后的進行支原體的檢測，方法同上。

《發光法支原體檢測試劑盒》靈敏度測試

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我們以支原體液體培養基培養數天的M. hyorhinis支原體活菌（豬鼻支原體）作為陽性，空白支原體液體培養基作為陰性，使用《發光法支原體檢測試劑盒》進行檢測。結果如下：

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   說明：從本表可知，在每個反應孔的活菌加入量為50μL的情況下，《發光法支原體檢測試劑盒》的檢測下限（即需要樣品的發光值與陰性對照的發光值的比值大于1.2）大約為2200個活菌/μL。

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注：《發光法支原體檢測試劑盒》檢測靈敏度詳細數據，請參考其方法學報告。