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Shanghai Yise Medical Technology Co.,Ltd.

二、本公司四種快速《支原體檢測試劑盒》選購指南

  運輸費和陽性對照說明

《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》采取冰袋運輸或常溫運輸，每批貨收取25元的快遞運輸費。

《發光法支原體檢測試劑盒》和《發光法陽性對照》采取干冰運輸，每批貨收取150元的干冰運輸費。

《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》本身含陽性對照，無需單獨購買。

《發光法支原體檢測試劑盒》本身不含陽性對照，《發光法陽性對照》（貨號：LPC10；含40次，價格600元）需要單獨購買。

《支原體基因組DNA提取試劑盒》（離心柱法）：50次/盒（貨號：MG015），每盒600元。

本公司四款不同原理的快速《支原體檢測試劑盒》的檢測靈敏度比較

        為了比較本公司開發的四款不同原理的快速《支原體檢測試劑盒》【分別是：《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》（簡稱“一步法”）、《PCR法支原體檢測試劑盒》（簡稱“PCR法”）、《發光法支原體檢測試劑盒》（簡稱“發光法”）和《探針法支原體檢測試劑盒》（簡稱“探針法”）】的檢測靈敏度高低，我們使用了以下兩種DNA作為模板：（1）含M. hyorhinis基因片段的質?！居捎凇鞍l光法”只能檢測活菌，該模板只比較了另外三種試劑盒】；（2）經支原體液體培養基培養數天的M. hyorhinis支原體活菌（豬鼻支原體）。

?         說明：四款快速《支原體檢測試劑盒》檢測靈敏度比較。從本表可知：（1）“探針法”的檢測靈敏度最高，其檢測下限可以達到5.6-10.8 copies/2μL；（2）其次是“PCR法”，與“探針法”的最高檢測靈敏度基本持平或略低一點；（3）“一步法”的檢測靈敏度比“PCR法”和“探針法”都要低，其檢測下限大約為22.5-172.3 copies/2μL；（4）“發光法”的檢測靈敏度最低，其檢測下限（即需要樣品的發光值與陰性對照的發光值的比值大于1.2）大約為2200個活菌/μL【10^(-3)稀釋度】。?

注：四款快速《支原體檢測試劑盒》各自檢測靈敏度詳細數據，請參考各自的方法學報告。

  

三、本公司四種快速《支原體檢測試劑盒》的具體選購步驟

首先，作為支原體檢測領域的共識：單獨使用目前市面上的任何一種支原體檢測試劑盒，都無法做到100%正確，既不會漏檢（假陰性），也不會多檢（假陽性）。嚴格的支原體檢測，至少需要使用兩種，最好使用三種不同原理的支原體檢測方法同時進行檢測，才能使檢測結果接近100%正確。如果幾種不同支原體檢測方法的檢測結果一致，正確率幾乎就是100%。

其次，您可以根據自己實驗室的條件、檢測時間長短、產品價格、支原體識別率、假陽性和假陰性概率、樣品是否需要前處理等進行綜合選擇。

最后，因為上述四種《支原體檢測試劑盒》中，只有《探針法支原體檢測試劑盒》和《PCR法支原體檢測試劑盒》的支原體識別率是100%，如果同時選擇兩種以上支原體檢測試劑盒，我們建議其中一種選擇《探針法支原體檢測試劑盒》（貨號：GM016）或者《PCR法支原體檢測試劑盒》（貨號：PM008。本試劑盒由于含內參條帶：可以區分真陰性樣品和假陰性樣品）。

如果您實驗室已經擁有（或者打算購買，注：可以考慮購買國產儀器，10萬以內）熒光定量PCR儀，我們強烈推薦您選擇《探針法支原體檢測試劑盒》，《探針法支原體檢測試劑盒》具有100%支原體識別率、最高的檢測靈敏度和最高的檢測正確率等一系列優點，該方法被認為是支原體快速檢測的金標準。單獨使用《探針法支原體檢測試劑盒》一種方法進行支原體檢測的準確率就可以達到同時使用其他兩種不同原理的支原體檢測方法所能達到的準確率。

以上四款支原體快速檢測試劑盒單獨使用的檢測正確率排序：最高的是《探針法支原體檢測試劑盒》（接近100%）；其次是《PCR法支原體檢測試劑盒》（在排除假陽性和假陰性后，接近100%）；再次是《發光法支原體檢測試劑盒》（99%左右）和《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》（98-99%左右）。

如果您想得到100%正確的支原體檢測結果（比如，開展細胞治療的客戶，進行干細胞培養的客戶，生產血清、胰酶、培養液的客戶，出售各種原代培養細胞系和腫瘤細胞系的客戶等），任選本公司生產的《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》、《發光法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》中的兩種進行檢測，將會得到比較滿意的結果。如果幾種不同支原體檢測方法的檢測結果一致，正確率就幾乎是100%。

    如果將所有待測樣品統一接種到支原體液體培養基【必須同時接種不含精氨酸和含精氨酸的支原體液體培養基】，然后在37℃培養箱中培養3-7天后，再用2-3種不同原理支原體檢測試劑盒同時進行檢測，則基本可以確保您的檢測結果100%正確！通過將待測樣品接種到支原體液體培養基培養3-7天的目的是：防止一些支原體含量極其微量的待測樣品（比如：細胞培養用的血清、胰酶、抗生素、培養液和極個別的細胞培養上清），如果不經過大量繁殖，有可能漏檢。

        注意：發光檢測（Luminescence）與熒光檢測（Fluorescence）、吸收光檢測（Absorbtance）是不同的功能。吸收光檢測即最常用的OD值檢測。熒光檢測（比如常見的FITC檢測）需要激發光，而發光檢測（如熒光素酶的活性檢測）不需要激發光。多功能酶標儀常見的檢測功能有：吸收光檢測、熒光檢測和發光檢測，三種功能為獨立的功能。您如果不清楚您實驗室的酶標儀是否具有發光檢測功能，請咨詢您的實驗室主任或者酶標儀廠家。

支原體檢測樣品的分類：

支原體檢測樣品可以分成兩類：

     第一類：用含血清的培養液培養的哺乳動物細胞上清液，由于該條件非常適合支原體生長，培養數天后，支原體密度一般較高，可達10^7-9/mL（即每微升10^4-6copies，數據來自參考文獻4），可以直接檢測。

     第二類：低溫保存的血漿、血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養液等樣品，由于這些樣品即使有支原體污染，支原體含量一般很少(比如:1毫升就只有幾個)，如果直接檢測，漏檢可能性較大。這些樣品建議：（1）對樣品的支原體進行離心濃縮或者使用本公司《支原體基因組DNA提取試劑盒》將支原體DNA濃縮提取，該兩種方法大約可以將檢測靈敏度繼續提高10-100倍。該方法速度快，當天出結果，但是可靠性不如后面的培養法。（2）使用支原體液體培養基（必須同時接種不含精氨酸和含精氨酸的兩種支原體液體培養基）培養3-7天后，再進行檢測。具體方法請參考本公司《發光法支原體檢測試劑盒》說明書中最后的注意事項部分。該方法速度較慢，需要3-7天，但是可靠性高。

關于支原體檢測試劑盒靈敏度的問題

針對上述兩種類型的支原體檢測樣品：

      對于第一類樣品（用含血清的培養液培養的哺乳動物細胞上清液），由于其支原體密度一般較高，可達10^7-9/mL（即每微升10^4-6copies，數據來自參考文獻4），選用本公司生產的上述任何一種支原體檢測試劑盒，其靈敏度一般都沒有問題（細胞上清中的支原體密度一般已經大于檢測的靈敏度下限）。

      對于第二類樣品（低溫保存的血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養液等），由于這些樣品即使有支原體污染，支原體含量一般很少(比如:1毫升就只有幾個)，如果直接檢測，漏檢可能性較大。這些樣品強烈建議使用支原體液體培養基（必須同時接種不含精氨酸和含精氨酸的兩種支原體液體培養基）培養3-7天后再進行檢測。培養后，由于支原體含量已經大幅度提升，選用本公司生產的上述任何一種支原體檢測試劑盒，其靈敏度都沒有問題?！?/span>對于第二類樣品的折中方法是：對樣品的支原體進行離心濃縮或者使用本公司《支原體基因組DNA提取試劑盒》將支原體DNA濃縮提取，該兩種方法大約可以將檢測靈敏度繼續提高10-100倍。該方法速度快，當天出結果，但是可靠性不如后面的培養法。】

  所以：總體來說，只要樣品分別按照上述兩種方法進行操作（細胞上清直接檢測，其他預期支原體密度很低的樣品用支原體液體培養基培養3-7天后檢測），支原體檢測的靈敏度都不是問題。

如果使用PCR法檢測支原體，完全沒有必要選用所謂的《巢式PCR法支原體檢測試劑盒》（詳見下文介紹），使用巢式PCR法檢測支原體有三個缺點：（1）該方法一般不帶內參對照，無法區分真陰性樣品和假陰性樣品；（2）整個檢測過程耗時太久，往往需要6-8小時；（3）由于經過兩輪PCR擴增，極易產生假陽性。使用本公司生產的《PCR法支原體檢測試劑盒》其靈敏度已經可以達到每微升10個copies左右，已經完全可以滿足細胞培養上清液中支原體檢測的靈敏度需求。

四、各公司《PCR法支原體檢測試劑盒》選購注意事項 

目前，PCR法支原體檢測仍然是支原體快速檢測領域被客戶選購最多的方法。目前，商業化的PCR法支原體檢測方法就有好幾種，各優缺點分述如下：

 （1）不帶內參基因的普通PCR法支原體檢測試劑盒。該試劑盒含有2條引物，不帶內參基因。通過30-35輪的普通PCR直接檢測。需要通過瓊脂糖電泳分析檢測結果，整個檢測過程耗時3-4小時。缺點：無法區分真陰性樣品和由于細胞代謝產物抑制導致的假陰性樣品（二者，支原體特異條帶均為陰性）。

 （2）帶內參基因的普通PCR法支原體檢測試劑盒。該試劑盒含有2條引物，帶內參基因。通過30-35輪的普通PCR直接檢測。需要通過瓊脂糖電泳分析檢測結果，整個檢測過程耗時3-4小時。優點：可以區分真陰性樣品（內參條帶為陽性而支原體特異條帶為陰性）和由于細胞代謝產物抑制導致的假陰性樣品（內參條帶和支原體特異條帶均為陰性）。

 （3）巢式PCR法支原體檢測試劑盒。該試劑盒含有4條引物，一般不帶內參基因。第一輪，用2條外引物通過30輪的PCR擴增后；第二輪，取少量第一輪的擴增產物作為模板，用2條內引物再進行30輪的PCR擴增。需要通過瓊脂糖電泳分析檢測結果，整個檢測過程耗時6-8小時。缺點：耗時太久，容易產生假陽性、也無法區分真陰性樣品和假陰性樣品。

 （4）不帶內參基因的熒光定量PCR法支原體檢測試劑盒。該試劑盒含有2條支原體特異性引物及相應熒光探針，不帶內參基因。通過40-45輪的定量PCR檢測。無需通過瓊脂糖電泳分析檢測結果，整個檢測過程耗時2小時左右。缺點：如果樣品有不經過DNA提取，則無法區分真陰性樣品和由于細胞代謝產物抑制導致的假陰性樣品（二者，均顯示為沒有擴增）。

 （5）帶內參基因的熒光定量PCR法支原體檢測試劑盒。該試劑盒含有2條支原體特異性引物和2條內參引物及各自熒光探針。通過40-45輪的定量PCR檢測。無需通過瓊脂糖電泳分析檢測結果，整個檢測過程耗時2小時左右。優點：可以區分真陰性樣品（內參檢測熒光通道為陽性而支原體檢測熒光通道為陰性）和由于細胞代謝產物抑制導致的假陰性樣品（內參檢測熒光通道和支原體檢測熒光通道均為陰性）。

由于PCR法支原體檢測過程中，PCR的擴增可能會被細胞的代謝產物抑制的問題，是該方法的致命弱點。Sigma公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit（貨號MP0035）的PCR法支原體檢測試劑盒說明書中也特別提到了這點，說明這是一個PCR法支原體檢測中經常遇到的問題，其強烈建議用試劑盒進行DNA提取后再進行鑒定。

 上述5種PCR支原體檢測方法中，只有方法（2）和（5）可以區分真陰性樣品和由于細胞代謝產物抑制導致的假陰性樣品。所以，大家選購各公司的PCR法支原體檢測試劑盒時，如果不打算進行樣品DNA的提取，盡量選取含內參基因的上述方法（2）類和（5）類的支原體檢測試劑盒，比如：本公司的《PCR法支原體檢測試劑盒》（貨號：PM008）和本公司的《探針法法支原體檢測試劑盒》（貨號：QM016）。

PCR法檢測體外培養細胞的支原體時，PCR擴增可能會被細胞代謝產物抑制，從而導致假陰性結果：

（截圖來自Sigma公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit，貨號MP0035說明書）

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五、支原體污染細胞的危害（1）?

?培養的細胞被支原體污染后，幾乎可以改變細胞的所有功能，其可以導致細胞染色體的異常和損傷，改變細胞的代謝、生長、形狀、附著，影響病毒的擴增能力和產量等等。例如，Miller CJ等人通過Microarray的研究表明：支原體污染嚴重改變被污染細胞的基因表達譜 [1, 2]，支原體污染后與無污染的同一細胞系相比，表達差異達2倍以上的基因就有200多個?。。。ㄔ敿殧祿堃妳⒖嘉墨I 1）。Edward Burnett 和 Liz Penn認為：被支原體污染的細胞系已經不是原來的細胞系，而是另外一個細胞系了 [3]！此外，嚴重的支原體污染將徹底摧毀一株細胞系。

從2013年開始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及細胞培養都要進行支原體檢測。相信會有越來越多的高水平期刊將做出同樣的支原體檢測要求。

?總之，在細胞系上進行生物醫學方面的科學研究，如果不能保證所用的細胞系無支原體污染（Mycoplasma-free），則所得出的結論是極端不可靠甚至是完全錯誤的！可以想象：全球范圍內，每年因支原體污染導致白白浪費的科研經費的數量是多么的巨大，有人估計至少高達數十億美金！

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?????????支原體污染細胞的危害（2）????????

1.       細胞生物學：支原體污染將直接導致最常用的MTT細胞毒性實驗結果的嚴重錯誤！

 

  結果：由于支原體對MTT的額外還原作用，對阿霉素（Doxorubicin, 一種抗腫瘤藥物）的抗性，支原體污染和非污染的細胞二者相差15倍?。?/span>Due to an additional reduction of tetrazolium by mycoplasmas, contaminated cells appeared up to 15 fold resistant to doxorubicin.）

  參考文獻：Falsification of tetrazolium dye (MTT) based cytotoxicity assay results due to mycoplasma contamination of cell cultures. Anticancer Res. 1999 Mar-Apr; 19(2A):1245-8.

 

2.       免疫學：支原體污染本身將可以直接誘導樹突狀細胞的成熟！這對于目前國內外普遍開展的人體免疫細胞的腫瘤治療將是災難性的。

 

結果：（1）The capacity of these cell lines to induce DC maturation was due to their contamination by mycoplasma. Our results reveal that DC are able to sense mycoplasma infection and mature as they do in response to most viruses and bacteria.（2）Further investigation demonstrated that the changes in DC phenotype and functions were due to the presence of mycoplasmas in these two cell lines; eradication of mycoplasmas completely abolished the observed effects, and importantly, pure mycoplasmas in the absence of tumor cell supernatants were able to produce the same effects.

參考文獻：（1）Dendritic cell maturation is induced by mycoplasma infection but not by necrotic cells. Eur. J. Immunol. 2000.30: 705–708。（2）Mycoplasma-mediated alterations of in vitro generation and functions of human dendritic cells. J Biomed Sci. 2005;12(1):31-46.

 

3.       神經生物學：支原體污染本身可以直接降解淀粉樣多肽Amyloid-beta (Abeta)！

 

結果：These data show that mycoplasmas degrade Abeta and thus may represent a significant source of variability when comparing extracellular Abeta levels in different cell lines.

參考文獻：（1）Amyloid-beta peptide degradation in cell cultures by mycoplasma contaminants. BMC Res Notes. 2008 Jun 30;1:38.（2）Neuroprotective effects of Mycoplasma hyorhinis against amyloid-β-peptide toxicity in SH-SY5Y human neuroblastoma cells are mediated by calpastatin upregulation in the mycoplasma-infected cells. Neurochem Int. 2011 Mar;58(4):497-503.

 

4.       生物化學：支原體污染可以直接影響L-arginine的代謝！

 

結果：This demonstrates that infection with M. hyorhinis leads to different effects on gene regulation of the murine and human iNOS gene. Our study underlines the importance of routine checking of cell cultures for mycoplasma contamination, particularly in studies on NO-mediated effects or inflammatory processes.

參考文獻: Impact of Mycoplasma hyorhinis infection on L-arginine metabolism: differential regulation of the human and murine iNOS gene. Biol Chem. 2005 Oct;386(10):1055-63.

 

5.       病理學：支原體污染可以直接刺激前列腺素E2（Prostaglandin E2）的產生！

 

結果：Mycoplasma fermentans (MF) also stimulated PGE(2) production. The co-infection of mycoplasma and Chlamydia resulted in an additive effect in the production of PGE(2). Thus it is important to use host cells and Chlamydia free of mycoplasma contamination for the analysis of Chlamydia-induced prostaglandin production.

參考文獻:Production of prostaglandin E2 in monocytes stimulated in vitro by Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, and Mycoplasma fermentans. Microb Pathog. 2004 Sep;37(3):155-61.

 

?六、如何獲得100%正確的支原體檢測結果？

可以說，到目前為止，針對體外細胞培養的支原體檢測的方法還沒有一種單獨使用就可以保證100%正確，既不會漏檢（假陰性），也不會多檢（假陽性）。

（1）支原體固體培養法。通過固體培養法無法檢測污染細胞的一種最常見的支原體，即豬鼻支原體（M.Hyorhinis）。這是因為豬鼻支原體無法在支原體固體培養基上形成可見的菌落，而豬鼻支原體約占所有支原體污染的20-50%。這就意味支原體固體培養法漏檢率高達20-50%。

（2）PCR法。PCR法導致的假陽性大家比較熟悉，無需多說。值得注意的是，由于細胞培養液中，經常會含有強烈抑制PCR擴增的代謝產物，如果不進行樣品的前處理而直接使用細胞培養原液進行PCR檢測，產生假陰性的概率是非常大的。

（3）熒光染色法。由于該方法本身的靈敏度較低，輕度的支原體污染往往無法檢測出來。該方法漏檢率也不會低。

（4）檢測支原體特異性酶的方法，比如Lonza公司的MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit和本公司生產的《發光法支原體檢測試劑盒》。主要缺點是發光值有一定的波動，處于檢測下限邊緣的讀值可能會造成誤判。

（5）《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》該方法盡管有許多優點，但是目前為止，我們只能保證該試劑盒能檢測出說明書上列舉的13種支原體，雖然這13種支原體大約占了所有污染細胞的支原體種類的99%左右，但是該方法也不能保證100%的支原體檢出率。

        綜上所述，單獨使用目前市面上的任何一種支原體檢測試劑盒，都無法做到100%正確，既不會漏檢（假陰性），也不會多檢（假陽性）。嚴格的支原體檢測，至少需要使用兩種，最好使用三種不同原理的支原體檢測方法同時進行檢測，才能使檢測結果接近100%正確。

        如果您想得到100%正確的支原體檢測結果（比如，開展細胞治療的客戶，進行干細胞培養的客戶，生產血清、胰酶、培養液的客戶，出售各種原代培養細胞系和腫瘤細胞系的客戶等），任選本公司生產的《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》、《發光法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》中的兩種進行檢測，將會得到比較滿意的結果。如果幾種不同支原體檢測方法的檢測結果一致，正確率幾乎就是100%。

七、 ?支原體相關知識簡介

???（1）支原體簡介：

支原體（Mycoplasma）是一種沒有細胞壁的原核生物，大小約0.3- 0.8微米。目前，已發現的支原體品種有100多種。其中，有近20種曾經在各種細胞培養體系中檢測到，但超過98%以上的支原體污染是由6-8種引起的（注：具體的支原體種類，《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》說明書中有詳細介紹）。而且同一種細胞經常被多種支原體污染。

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（?2）支原體污染細胞的途徑：

由于支原體直徑較小，經?？梢源┻^實驗室常規的0.20微米孔徑的除菌濾膜，高壓過濾時，甚至可以穿過0.10微米孔徑的除菌濾膜,造成細胞的支原體污染。

細胞培養的支原體污染來源主要有：（1）細胞之間的交叉污染，這是支原體污染的最主要原因；（2）細胞培養操作人員的口腔、皮膚等。（3）細胞培養用的組分，如血清、培養液等。

?（3）細胞支原體污染的隱蔽性：

由于支原體體積比細菌小很多，通常支原體污染密度非常的高，可達10^7-9/mL培養液，但即使這么高密度的支原體污染也無法通過普通顯微鏡的肉眼觀察進行判斷。

 而且，輕度到中度的支原體污染并不會導致細胞形態或生長速度的明顯改變，也不會明顯改變培養液的渾濁度或培養液的pH值。

 以上兩個原因就導致體外培養的細胞即使被支原體污染了，一般的科研工作者也不會覺察到。也就是說：如果不進行支原體的常規檢測，你甚至不知道你培養的細胞被支原體污染了，而污染的支原體卻在悄悄改變你的實驗數據和實驗結果，你卻被蒙在鼓里！

（4）?支原體污染細胞的比例：

據Corning公司報道，世界各國的細胞系都有不同程度的支原體污染,可以說支原體污染是細胞培養領域的一個世界性問題 [4]。表1是美國ATCC、FDA、以及其他兩家細胞檢測機構的支原體污染統計數據。表2是世界各國的細胞系污染比例。目前，世界各國細胞系支原體污染的平均比例為30-60%。

     表1，細胞支原體污染統計結果，數據來自參考文獻 [4]

表2，世界各國的細胞系污染比例，數據來自參考文獻 [4]

??參考文獻：

1.     Miller CJ, Kassem HS, Pepper SD, Hey Y, Ward TH, Margison GP. Mycoplasma infection significantly alters microarray gene expression profiles. Biotechniques. 2003 Oct;35(4):812-4.

2.    Aldecoa-Otalora E, Langdon W, Cunningham P, Arno MJ. Unexpected presence of mycoplasma probes on human microarrays. Biotechniques. 2009 Dec;47(6):1013-5.

3.     Edward Burnett and Liz Penn, European Collection of Cell Culture (ECACC?). Mycoplasma Detection and Elimination. Don Finley, Market Segment Manager, Sigma? Life Science. Biofiles, Vol. 8, No. 18

4.     John Ryan (2008). "Understanding and Managing Cell Culture Contamination". Corning Incorporated. 1-24.

八、如何檢測血清是否含有支原體污染？

      血清有沒有支原體污染這是細胞培養用戶非常關心的問題。其檢測方法有相當的特殊性，現介紹如下：

1. 必須認識到血清不適合直接檢測，在對其進行檢測之前，必須將其中可能含有的支原體進行大量的繁殖。這是因為：商品化的血清都是經過0.1 μm的濾膜多次過濾的而且長期低溫保存和運輸，其中即使含有支原體，其含量也必然是極其微量的（比如1 mL就含有幾個支原體），直接檢測一般是檢測不出來的?！驹擃悩悠氛壑械姆椒ㄊ牵菏褂帽竟尽吨гw基因組DNA提取試劑盒》，將支原體DNA濃縮提取后再進行檢測，大約可以將檢測靈敏度繼續提高10-100倍。該方法速度快，當天出結果，但是可靠性不如培養法?！?/span>

2. 血清樣品中支原體的繁殖方法：分別取1 mL的血清，按1:10稀釋到2種不同的支原體液體培養基（其中一種不含精氨酸，另外一種含精氨酸）中【注意：（1）因為每種支原體的營養需求不一樣，2種支原體液體培養基都必須同時接種和培養；（2）血清接種的量不能太小，一般接種不少于1 mL，否則可能漏檢；（3）不能使用常規的哺乳動物細胞培養液代替支原體液體培養基。因為經我們測試：在沒有動物細胞共培養的情況下，支原體在含10%血清的動物細胞培養液如DMEM、1640、 MEM、GMEM中繁殖非常緩慢，甚至完全不繁殖?！?，然后部分放4 ℃冰箱，部分放37 ℃二氧化碳培養箱或者普通的細菌培養箱中培養3-7天【對于生長速度快的支原體，3天的培養已經足夠；對于生長速度慢的支原體，培養的時間可以適當延長】。3-7天后，進行支原體的檢測【建議培養3天和7天后各檢測一次】。

3. 培養3-7天后的樣品中支原體的檢測方法，可以在本公司《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》、《發光法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》中任選1-3種進行檢測。由于，血清是否含有支原體，事關重大，我們建議至少同時使用兩種（最好使用三種）方法進行檢測（其中一種我們推薦使用含內參對照的《PCR法支原體檢測試劑盒》或者選擇《探針法支原體檢測試劑盒》，因為只有這兩種試劑盒支原體識別率達到100%）。

4. 如果選擇《發光法支原體檢測試劑盒》進行檢測，具體操作如下：以放4 ℃冰箱的含10%待測血清的支原體液體培養基作為陰性對照，用《發光法支原體檢測試劑盒》檢測培養箱中培養3天的培養液，其發光值是否明顯增高，從而判斷最初加入的血清是否含支原體。

5. 當然，培養3-7天后的樣品，也可以用《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》或《探針法支原體檢測試劑盒》進行檢測。用這即種方法進行檢測時，建議同時檢測原液和1:10的稀釋液，稀釋液用PBS。這是因為：（1）原液仍然含有10%的血清，其仍然有可能抑制PCR的擴增；（2）一個樣品同時檢測兩個稀釋度，對于結果判斷的準確性非常有幫助。結果判斷如下：（1）如果兩個稀釋度的檢測結果都為陰性，說明血清沒有支原體污染；（2）兩個稀釋度的檢測結果只要一個為陽性，說明血清有支原體污染，而且極有可能是污染了活支原體。最常見的結果是兩個稀釋度都為陽性或兩個稀釋度都為陰性。

6. 本公司同時提供2種支原體液體培養基（干粉型）產品，其中一種不含精氨酸，另外一種含精氨酸。大家購買后，自己按說明書配成支原體液體培養基，其中的馬血清可以不加，而用待測的胎牛血清代替（終濃度10%即可）。其中的青霉素可以不用添加或者用細胞培養用的青霉素和鏈霉素（100×，按1:100加入）代替。1瓶支原體液體培養基（干粉型）大約可以檢測1000個血清樣品。

7. 如果大家覺得上述檢測非常繁瑣，本公司同時供應經上述步驟嚴格檢測，證明100%不含活支原體的精選進口胎牛血清。

其他：如何檢測胰酶、抗生素、未使用的動物細胞培養液等細胞培養相關試劑是否含有支原體污染？

這些樣品也不適合直接檢測。方法與血清的檢測方法非常類似，在對其進行檢測之前，也必須將其中可能含有的支原體進行大量的繁殖。首選，必須先檢測支原體液體培養基中含有的血清是否被支原體污染，在保證血清沒有支原體污染的前提下，配制含10%經證明沒有支原體污染的血清的支原體液體培養基，然后將不少于1 mL的胰酶、抗生素或者動物細胞培養液等按1:10稀釋到該培養基中，然后部分放4 ℃冰箱，部分放37 ℃二氧化碳培養箱或者普通的細菌培養箱中培養3-7天，3-7天后的進行支原體的檢測，方法同上。

九、細胞支原體污染重要文獻介紹?

 (1) Falsification of tetrazolium dye (MTT) based cytotoxicity assay results due to mycoplasma contamination of cell cultures.

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 (2) Dendritic cell maturation is induced by mycoplasma infection but not by necrotic cells.

 (3) Mycoplasma-mediated alterations of in vitro generation and functions of human dendritic cells.

 (4) Amyloid-beta peptide degradation in cell cultures by mycoplasma contaminants.

 (5) Neuroprotective effects of Mycoplasma hyorhinis against amyloid-β-peptide toxicity in SH-SY5Y human neuroblastoma cells are mediated by calpastatin upregulation in the mycoplasma-infected cells.

 (6) Impact of Mycoplasma hyorhinis infection on L-arginine metabolism: differential regulation of the human and murine iNOS gene.

 (7) Production of prostaglandin E2 in monocytes stimulated in vitro by Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, and Mycoplasma fermentans.

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 (8) Mycoplasma hyorhinis-Contaminated Cell Lines Activate Primary Innate Immune Cells via a Protease-Sensitive Factor.

 (9) Mycoplasma Infection Alters Cancer Stem Cell Properties in Vitro.

 (10) Metabolomics reveals mycoplasma contamination interferes with the metabolism of PANC-1 cells.