?上海易色醫療科技有限公司
Shanghai Yise Medical Technology Co.,Ltd.
《PCR法支原體檢測試劑盒》產品重要信息
（1）產品價格：《PCR法支原體檢測試劑盒》（貨號：PM008）；價格：1200元/100次（平均每個樣品12元）。
（2）產品說明書： PDF版說明書，請到本公司網站“下載中心”頁面下載！
（3）方法學報告：《PCR法支原體檢測試劑盒》方法學報告，請到本公司網站“下載中心”頁面下載！
《PCR法支原體檢測試劑盒》說明書（版本20220529）
【本說明書會不定期更新，每次收到新的產品時，請到本公司網站重新下載最新版本！】
貨號
PM008
包裝規格
100次/盒
儲存條件
該產品在常溫或隨冰袋運輸，收到產品后，請立即放-20 ℃冰箱低溫保存。該條件下，至少5年內有效。
產品用途
《PCR法支原體檢測試劑盒》（PCR Mycoplasma Detection Kit）可用于檢測一切可能含支原體的樣品，比如：（1）體外細胞培養的上清；（2）血清；（3）各種體液，如唾液、尿液、鼻腔分泌物等；（4）別的液體樣品。本產品僅供研究使用。
產品簡介
哺乳動物細胞的培養，支原體（Mycoplasma）污染是個世界性的問題。支原體污染幾乎可以改變細胞的所有參數，導致實驗結果的不準確、甚至完全錯誤（支原體污染對細胞的詳細危害，請參考本公司的網站：www.stylediaryblog.com）。從2013年開始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及細胞培養都要進行支原體檢測。相信會有越來越多的高水平期刊將做出同樣的支原體檢測要求。
培養法是相對可靠的支原體檢測技術，但是該方法非常耗時的，需要數周，不適合作為細胞培養液中支原體污染的快速檢測。此外，通過固體培養法無法檢測污染細胞的一種最常見的支原體，即豬鼻支原體（M.Hyorhinis）。這是因為豬鼻支原體無法在支原體固體培養基上形成可見的菌落。而豬鼻支原體約占所有支原體污染的20-50%。
有的實驗室使用熒光染色法檢測支原體，但是該方法靈敏度太低，而且嚴重依賴實驗人員的經驗，實驗的穩定性較差。此外，當該方法檢測成陽性時，細胞經常已經嚴重污染。
培養法和熒光染色法雖然是我國藥典收錄的支原體檢測方法，但是因為其各自都有明顯的缺點，不適合作為支原體快速檢測的方法。
本公司目前已經開發出四種不同原理的快速支原體檢測試劑盒，分別是：《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》、《發光法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》，其各有自己的優缺點（詳情請參考本公司網站）。
《PCR法支原體檢測試劑盒》具有100%支原體識別率、靈敏度極高、含內參條帶從而可以區分真陰性樣品和假陰性樣品、無需配套昂貴的熒光定量PCR儀等優點，是普通實驗室支原體檢測最常用的方法之一。
《PCR法支原體檢測試劑盒》主要缺點：（1）由于細胞代謝可能會產生抑制PCR的物質，樣品如果不進行前處理，可能產生假陰性；（2）PCR后需要進行瓊脂糖凝膠電泳，相對耗時較多。
經測試，本公司開發的《PCR法支原體檢測試劑盒》至少可以識別在體外細胞培養中曾經報道出現的20種支原體，根據文獻報道，這些支原體基本上占污染細胞的支原體種類的100%。具體如下：（1）M. hyorhinis、（2）M. fermentans、（3）M. arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M.pirum、（8）A. laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M. bovis、(11) M. bovoculi、（12）A. axanthum、（13）M. buccale、 (14) M. pneumoniae、（15）M. arthritidis、（16）M. pulmonis、（17）M. gallisepticum、（18）M. gallinarum、（19）M. canis、（20）Ureaplasma urealyticum（注：M.為Mycoplasma的縮寫；A.為Acholeplasma的縮寫）。根據支原體DNA的序列，本試劑盒可以識別100多種至今已發現的支原體，具有廣譜的識別能力。如果客戶發現除上述20種支原體外，還有其他的支原體也會污染體外培養的細胞，或者客戶純粹就是想檢測其他的支原體，請告訴我們支原體的名稱，我們將進行序列比對，然后告訴你本試劑是否可以識別。
《PCR法支原體檢測試劑盒》檢測靈敏度：經測試，配套使用Takara公司的Ex Taq Hot Start version， 本試劑盒的檢測下限為6-20個copies左右。即PCR擴增時，如果樣品DNA加入量為2 μL，則本試劑盒的最高檢測靈敏度為3-10個copies/μL。與本公司的《探針法支原體檢測試劑盒》的最高檢測靈敏度基本持平或略低一點?？梢酝ㄟ^離心濃縮、提取支原體基因組DNA、增加每個反應管中的DNA加入量等措施，其檢測靈敏度可以在此基礎上繼續提高10-1000倍。
此外，作為支原體檢測領域的共識，單獨使用任何一種支原體檢測方法，都無法做到100%正確，既不會漏檢（假陰性），也不會多檢（假陽性）。嚴格的支原體檢測，至少需要使用兩種（最好使用三種）不同原理的支原體檢測方法同時進行檢測，才能使檢測結果接近100%正確。
如果您想得到100%正確的支原體檢測結果（比如，開展細胞治療的客戶，進行干細胞培養的客戶，生產血清、胰酶、培養液的客戶，出售各種原代培養細胞系和腫瘤細胞系的客戶等），任選本公司生產的《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR法支原體檢測試劑盒》、《發光法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》中的兩種進行檢測，將會得到比較滿意的結果。如果幾種不同支原體檢測方法的檢測結果一致，正確率幾乎就是100%。
試劑盒組成
（1） 支原體引物和內參（100次）：206 μL；
（2） 陽性支原體DNA：50 μL；
（3） 去離子水：1.8 mL（請使用普通蒸餾水或去離子水，不能使用去內毒素的水）。
? 注意1：以下試劑需要自己準備：（1）Taq DNA 聚合酶和2.5 mM的dNTP 【推薦使用Takara公司的Ex Taq Hot Start version（首選。貨號： RR006A，可用400次）或者Ex Taq酶（貨號：RR001A，可用400次），二者均包含2.5 mM的dNTP。】；（2）6× DNA上樣緩沖液【也可以購買本公司生產的5× AgarOrange超級DNA上樣緩沖液，該緩沖液已含核酸染料，不需要接觸EB等致癌物質！】。
? 注意2：本試劑盒不能使用Takara公司的普通Taq酶（貨號：R001A），經測試：使用該酶的結果非常不穩定，靈敏度也較差。
檢測過程
1、 待測樣品的準備
為了準確判斷細胞是否有支原體的污染，待測的細胞培養液樣品需要取自換液后培養2-3天且匯合度在90%左右的細胞培養液上清（貼壁細胞）。懸浮培養的細胞也需要在換液傳代后，讓細胞生長2-3天再取培養液進行檢測?？梢园凑找韵聝煞N方法之一進行樣品的前處理：
方法一：直接檢測（該方法無法去除可能的抑制物，PCR擴增被抑制的可能性較大）：
（1）取150 μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內，在普通臺式離心機上1000 rpm (大約150 g)低速離心5 minutes，取離心后的上清100 μL用于支原體檢測，丟棄下層剩余的50 μL（含細胞沉淀）。
（2）已經離心去除細胞的待測樣品可以直接檢測，也可以進行熱處理后再檢測（熱處理后，樣品保存更穩定），具體如下：95 ℃加熱處理5 minutes（可以轉移到PCR管內，在PCR儀上進行加熱處理），簡單離心（1000 g，5 seconds）后，取上清進行檢測。
方法二：簡單離心清洗（推薦方法。該方法不僅可以濃縮支原體從而提高檢測的相對靈敏度，還可以去除絕大部分可能的抑制物，PCR擴增被抑制的可能性大幅度降低。如果該簡單一步離心清洗的方法仍然無法去除抑制物，可以使用后文注意事項部分的三步離心清洗的方法）：
（1）根據濃縮倍數，可以取100 - 1500 μL上述待測樣品到1.5 mL離心管內，在普通臺式離心機上1000 rpm (大約150 g)低速離心5 minutes，將離心后的上清轉移到另一個離心管內，丟棄細胞沉淀。
（2）將上清繼續13000 rpm（約16000 g）高速離心5 minutes，小心吸走全部上清（為避免碰到底部沉淀，可以保留底部3-5 μL液體），用20-50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8（樣品可以長期保存。推薦）或者去離子水（樣品比較不穩定，只適合當天或短期內檢測使用）重懸沉淀（沉淀中含有支原體），吹吸均勻【如果最初使用了1500 μL的樣品而最后用20 μL重懸，則支原體濃度大約提高了75倍，相對靈敏度也提高了75倍】。
（3）該重懸后的樣品可以直接檢測，也可以進行熱處理后再檢測（熱處理后，樣品保存更穩定）。熱處理具體如下：95 ℃加熱處理5 minutes（可以轉移到PCR管內，在PCR儀上進行加熱處理），簡單離心（1000 g，5 seconds）后，取上清進行檢測。
? 注1：這里的細胞培養上清不是指細胞經胰酶消化后的離心上清，而是指至少培養2天后的貼壁細胞培養液上清（不需要胰酶消化，也不能取經胰酶消化后的離心上清進行檢測）或懸浮細胞培養液。
? 注2：本步驟的低速離心是為了去除哺乳動物細胞，以排除其不必要的干擾。所以離心力要嚴格控制在150-200 g，該離心力下，哺乳動物細胞將被沉淀下來而支原體不會。如果錯誤使用更高的離心力將可能導致支原體也被離心下來，從而導致假陰性。
? 注3：收集的待測細胞培養液樣品如果不立即檢測，請放于-20℃或-80℃冰箱保存，不得放于室溫或4℃冰箱。樣品在-20℃至少可以保存一個月，在-80℃可以長期保存。此外，為了節約檢測成本，可以將不同時間收集的樣品放于-20℃或-80℃冰箱保存，而后一起檢測。
? 注4：如果預期待測樣品支原體含量較少（比如，低溫保存的血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養液、生物制品、極個別細胞培養上清等），可以采取措施以提高檢測的靈敏度，具體方法請看后文注意事項部分：如果提高本試劑盒檢測靈敏度。
2、 PCR體系的配制【本步驟所有操作強烈建議使用進口濾芯吸頭（比如Axygen濾芯吸頭）進行操作，以避免試劑被污染。操作之前，請認真看完后文的注意事項后，再進行操作】：
2.1如果樣品總數為N（N=待測樣品數+1個陽性對照+1個陰性對照），請按下表（表1）進行PCR體系（總體積25 μL）的配制:
表1. PCR擴增體系的配制（以使用Takara公司的Ex Taq Hot Start version為例舉例說明）
單個樣品體積（μL） 樣品總數 總體積（μL）
去離子水 16.375 N 16.375×N×1.06
Takara 10× Ex Taq buffer(含Mg2+) 2.5 N 2.5×N×1.06
2.5 mM dNTP 2 N 2×N×1.06
Takara 5 Units/μL Ex Taq Hot Start 0.125 N 0.125×N×1.06
支原體引物和內參 2 N 2×N×1.06
? 舉例：1）如果待測樣品為8個（加上1個陰性和1個陽性對照），則樣品總數為10個。去離子水的總體積為16.375×10×1.06=173.575 μL；Takara 10× Ex Taq buffer(含Mg2+)的總體積為2.5×10×1.06=26.5 μL；2.5 mM dNTP的總體積為2×10×1.06=21.2 μL；Takara 5 Units/μL Ex Taq Hot Start的總體積為0.125×10×1.06=1.325 μL；支原體引物和內參的總體積為2×10×1.06=21.2 μL。將上述幾種溶液混合均勻即可。
? 注意1：總體積中多配制6%（客戶如果覺得該比例不合適，可以自己調整），是為了防止移液誤差，以保證每個反應管中的反應液足量。
? 注意2： 如果有條件，PCR體系的配制最好在冰上進行操作。
? 注意3：本試劑盒不推薦使用2×的PCR mixture（內含Taq酶、緩沖液和dNTP），建議使用Taq酶、10×Taq緩沖液和dNTP等試劑自己配置PCR體系。如果使用2x的PCR mixture，那么PCR的反應體系（25 μL）應該按照如下進行配置：2×的PCR mixture（12.5 μL）、支原體引物和內參的體積（2 μL）、陽性支原體DNA或待測樣品的體積（2 μL）,然后用去離子水補足到總體積25 μL。
? 注意4： PCR的反應體積（25 μL）、支原體引物和內參的體積（2 μL）、陽性支原體DNA或待測樣品的體積（2 μL），這是經過優化后的最佳體積，不能隨意改變，否則檢測結果容易不穩定。
? 注意5：為了避免可能的污染，收到的支原體引物和內參，可以適當分裝（比如：每支40 μL）后冷凍保存。
? 注意6：如果使用的是其他Taq酶（前提是：陰性對照的586 bp內參條帶必須有一定亮度，且穩定性良好，否則不能使用），酶的加入量需要根據其說明書進行調整，去離子水的加入量也要相應調整。
2.2將上述配制好的PCR反應體系，吹打均勻后，按每管23 μL分裝到0.2 mL的PCR管中。
2.3 待測樣品管加入2 μL待測樣品，陰性對照管加入2 μL去離子水（為防止去離子水被污染，此處建議使用20 μL移液槍配合200 μL吸頭進行吸取操作），陽性對照管加入2 μL陽性支原體DNA。每管反應液的總體積為25 μL。
? 注：1）裝有陽性支原體DNA的螺口管請不要高速離心，開蓋之前，只要用手指捏住，用力甩一下即可。吸取之前，請吹吸均勻后再吸取。如果不小心高速離心了，務必吹吸均勻后再吸取。2）進行反應體系配制的房間，與樣品前處理、加陽性對照DNA、樣品DNA的房間最好分開。
3、 PCR設置參數
1 cycle 94 ℃ for 2 minutes
40 cycles 94 ℃ for 15 seconds
55 ℃ for 15 seconds
72 ℃ for 45 seconds
1 cycle 72 ℃ for 5 minutes
1 cycle 8 ℃ forever
? 注意：PCR參數請不要更改，否則可能導致內參或陽性條帶擴增失敗。
4、 PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳
（1） 配制含溴化乙錠（EB）的濃度為1.5%的DNA瓊脂糖凝膠【注：（1）如果不想接觸強致癌物EB，可以使用本公司生產的5× AgarOrange超級DNA上樣緩沖液，使用該產品無需在凝膠中預先加入核酸染料。具體使用方法，請參見本公司網站的說明書。（2）瓊脂糖凝膠的最佳濃度為1.5%，此濃度下，條帶分離效果最好?！?/span>
（2） 往每個擴增后的PCR管內加入5 μL 6× DNA上樣緩沖液。
（3） 取上述含DNA上樣緩沖液的PCR產物10 μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
（4） 當溴酚藍染料跑出上樣孔3-4厘米左右時，停止電泳，拍照。
結果判斷
PCR擴增的結果有可能出現以下幾種情況（表2）：
注意事項
1、 每次檢測都應該設有陰性對照，作用有：
（1）由于有效的PCR擴增，陰性對照也會有一條586 bp的內參條帶，這樣可以保證本試劑盒含有的支原體引物和內參以及自己準備的Taq DNA 聚合酶，dNTP等試劑沒有問題；
（2）只有當陰性對照的結果沒有出現270 bp左右的支原體特異條帶時，其他樣品的檢測結果才是可信的。
2、 每次試驗陰性對照中586 bp的內參條帶都必須出現而且要有一定的亮度，才說明試驗成功。如果陰性對照的內參條帶經常沒有出現或者非常弱，說明試驗不成功，這時可以采取以下幾個措施：
（1） 請使用普通蒸餾水或去離子水。不能使用去內毒素的水、DEPC處理的水或者商品化的DNase/RNase-free的水，這幾種水都可能會抑制PCR擴增的效率。
（2） 請使用Takara公司的Ex Taq Hot Start version（首選。貨號： RR006A，可用400次。）或者Ex Taq酶（貨號：RR001A，可用400次）。
（3） 可以嘗試增加PCR的循環數，比如：由原來的40個循環，增加到45個循環。
如果采取以上幾個措施后，陰性對照的內參條帶仍然經常沒有出現或者非常弱，請聯系廠家解決。
3、 如果個別樣品有非特異性擴增，請使用Takara Ex Taq Hot Start version（首選。貨號： RR006A，可用400次。）
4、 如果直接使用細胞培養液上清進行檢測，而檢測結果顯示該樣品586 bp條帶和270 bp左右的條帶都沒有出現（如圖1，泳道6）或者內參條帶非常微弱，在排除PCR試劑的問題后（即陰性對照可以正常擴增），說明該樣品含有抑制PCR擴增的代謝產物。
有關PCR的擴增會被細胞的代謝產物抑制的問題，Sigma公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit（貨號MP0035）的PCR法支原體檢測試劑盒說明書中也特別提到了這點，說明這是一個PCR法支原體檢測中經常遇到的問題，其強烈建議用試劑盒進行DNA提取后再進行鑒定。這也是PCR法支原體檢測的致命弱點。
為了克服該問題，您購買的PCR法支原體檢測試劑盒，其擴增產物中必須含有內參（Internal Contol）條帶作為對照【本試劑盒的586 bp條帶就是內參條帶】。否則，如果沒有內參作為對照，即使樣品擴增后沒有支原體特異條帶，你也無法確定是因為樣品確實沒有支原體還是因為PCR被細胞的代謝產物抑制導致的假陰性。
如果出現PCR的擴增被細胞的代謝產物抑制時，可以采取以下幾種措施：
（1） 將取樣的時間提前到換液后2天或3天，此時細胞上清的PCR擴增抑制物相對比較少，一般不會產生嚴重的抑制。據我們測試，換液后5天，PCR擴增抑制物就已經大量積累。
（2） 用PBS對待測樣品進行離心清洗，去除樣品中的抑制物。具體方法如下：取1 mL細胞上清，先13000 rpm離心5 minutes，吸走950 μL上清；加PBS 950 μL，再次離心，吸走950 μL上清；再加PBS 950 μL，第三次離心，吸走全部上清，用20-50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重懸沉淀，95 ℃加熱處理5 minutes，簡單離心（1000 g，5 seconds）后，取上清進行檢測。但是該方法有如下缺點：第一，如果樣品支原體含量較少，離心清洗可能導致漏檢，因為離心清洗過程中，可能導致支原體部分丟失。第二，個別樣品，即使經過上述清洗也無法徹底去除抑制劑。
（3） 使用支原體基因組DNA抽提試劑盒（推薦使用本公司《支原體基因組DNA提取試劑盒》），抽提細胞上清的支原體DNA后再進行PCR鑒定。
（4） 使用本公司生產的《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》或者《發光法支原體檢測試劑盒》進行檢測，經測試，未發現這兩種試劑盒會被細胞的代謝產物所抑制。
為了預防PCR的擴增被細胞的代謝產物抑制的問題，也可以考慮將所有待測樣品全部進行離心清洗或者DNA提取后，再使用本試劑盒進行檢測。
5、 如發現細胞被支原體污染，本公司提供細胞專用支原體清除和預防試劑，以及水浴專用殺菌劑和環境專用殺菌劑。
6、 防DNA污染注意事項：
（1） 強烈建議所有操作全部使用進口濾芯吸頭（比如：Axygen濾芯吸頭）進行操作，以免試劑被污染。
（2） “PCR體系配制的房間、移液槍”（不要使用細胞培養室的移液槍?。┖汀癙CR產物的電泳房間、移液槍”一定要分開，不能在同一個房間進行，也不能使用相同的移液槍進行操作。
（3） PCR產物是導致假陽性的最主要原因，PCR產物不要在PCR體系配制的房間中打開。
（4） 樣品處理的房間和移液槍，如有條件，最好也分開。
（5） 收到的支原體引物和內參，可以分裝（比如40微升一支）后保存。
（6） 如果發現陰性對照也出現陽性條帶，說明發生DNA污染，必須將PCR所有的試劑、引物和水都換新的。
7、 支原體檢測樣品可以分成兩類：第一類，用含血清的培養液培養的哺乳動物細胞上清液，由于該條件非常適合支原體生長，培養數天后，支原體密度一般較高，可達107-9/mL，可以直接檢測。第二類，低溫保存的血漿、血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養液等樣品，由于這些樣品即使有支原體污染，支原體含量一般很少，直接使用快速支原體檢測試劑盒進行檢測，往往檢測不出來。這些樣品建議：（1）對樣品的支原體進行離心濃縮或者使用本公司《支原體基因組DNA提取試劑盒》將支原體DNA濃縮提取，該兩種方法大約可以將檢測靈敏度繼續提高10-100倍。該方法速度快，當天出結果，但是可靠性不如后面的培養法。（2）使用支原體液體培養基（必須同時接種不含精氨酸和含精氨酸的兩種支原體液體培養基）培養3-7天后，再進行檢測。具體方法請參考本公司《發光法支原體檢測試劑盒》說明書中最后的注意事項部分。該方法速度較慢，需要3-7天，但是可靠性高。
8、 如何提高本試劑盒檢測靈敏度：如果預期待測樣品支原體含量較少（比如，低溫保存的血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養液、生物制品、極個別細胞培養上清等），可以采取以下幾種措施：（1）通過使用本公司《支原體基因組DNA提取試劑盒》，將支原體DNA濃縮提取后再進行檢測（提取過程還可以把所有可能的PCR抑制劑全部去除），大約可以將檢測靈敏度提高10-100倍。（2）將PCR的循環數增加到45個循環。（3）對支原體進行離心濃縮：取1 mL細胞上清，先13000 rpm（約16000 g）離心5 minutes，吸走全部上清，用20-50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重懸沉淀，95 ℃加熱處理5 minutes，簡單離心后（1000 g，5 seconds），取上清進行檢測。該離心濃縮過程大約可以將檢測靈敏度提高20-50倍。（4）通過調整PCR反應體系，可以繼續提高檢測靈敏度10倍【調整后的PCR反應體系如下：PCR的反應體積為30 μL、10× Takara Ex Taq buffer(含Mg2+)為3 μL、2.5 mM dNTP為3 μL、5 Units/μL Takara Ex Taq Hot Start version 0.125 μL、支原體引物和內參的體積為2 μL、提取純化后或者離心清洗后的待測樣品DNA的體積為20 μL、陽性對照支原體DNA為2 μL、體系剩余部分加水補足到30 μL】。注意：沒有提取純化或者離心清洗的待測樣品，不能直接擴大待測樣品體積，否則PCR被抑制的可能性將大幅度增加。
9、 本說明書主要是利用細胞上清進行支原體污染檢測，如果有客戶想使用細胞本身而不是細胞培養上清進行支原體污染檢測，請聯系我們。
各公司《PCR法支原體檢測試劑盒》選購注意事項
目前，PCR法支原體檢測仍然是支原體快速檢測領域被客戶選購最多的方法。目前，商業化的PCR法支原體檢測方法就有好幾種，各優缺點分述如下：
（1）不帶內參基因的普通PCR法支原體檢測試劑盒。該試劑盒含有2條引物，不帶內參基因。通過30-35輪的普通PCR直接檢測。需要通過瓊脂糖電泳分析檢測結果，整個檢測過程耗時3-4小時。缺點：無法區分真陰性樣品和由于細胞代謝產物抑制導致的假陰性樣品（二者，支原體特異條帶均為陰性）。
（2）帶內參基因的普通PCR法支原體檢測試劑盒。該試劑盒含有2條引物，帶內參基因。通過30-35輪的普通PCR直接檢測。需要通過瓊脂糖電泳分析檢測結果，整個檢測過程耗時3-4小時。優點：可以區分真陰性樣品（內參條帶為陽性而支原體特異條帶為陰性）和由于細胞代謝產物抑制導致的假陰性樣品（內參條帶和支原體特異條帶均為陰性）。
（3）巢式PCR法支原體檢測試劑盒。該試劑盒含有4條引物，一般不帶內參基因。第一輪，用2條外引物通過30輪的PCR擴增后；第二輪，取少量第一輪的擴增產物作為模板，用2條內引物再進行30輪的PCR擴增。需要通過瓊脂糖電泳分析檢測結果，整個檢測過程耗時6-8小時。缺點：耗時太久，容易產生假陽性、也無法區分真陰性樣品和假陰性樣品。
（4）不帶內參基因的熒光定量PCR法支原體檢測試劑盒。該試劑盒含有2條支原體特異性引物及相應熒光探針，不帶內參基因。通過40-45輪的定量PCR檢測。無需通過瓊脂糖電泳分析檢測結果，整個檢測過程耗時2小時左右。缺點：如果樣品有不經過DNA提取，則無法區分真陰性樣品和由于細胞代謝產物抑制導致的假陰性樣品（二者，均顯示為沒有擴增）。
（5）帶內參基因的熒光定量PCR法支原體檢測試劑盒。該試劑盒含有2條支原體特異性引物和2條內參引物及各自熒光探針。通過40-45輪的定量PCR檢測。無需通過瓊脂糖電泳分析檢測結果，整個檢測過程耗時2小時左右。優點：可以區分真陰性樣品（內參檢測熒光通道為陽性而支原體檢測熒光通道為陰性）和由于細胞代謝產物抑制導致的假陰性樣品（內參檢測熒光通道和支原體檢測熒光通道均為陰性）。
由于PCR法支原體檢測過程中，PCR的擴增可能會被細胞的代謝產物抑制的問題，是該方法的致命弱點。Sigma公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit（貨號MP0035）的PCR法支原體檢測試劑盒說明書中也特別提到了這點，說明這是一個PCR法支原體檢測中經常遇到的問題，其強烈建議用試劑盒進行DNA提取后再進行鑒定。
上述5種PCR支原體檢測方法中，只有方法（2）和（5）可以區分真陰性樣品和由于細胞代謝產物抑制導致的假陰性樣品。所以，大家選購各公司的PCR法支原體檢測試劑盒時，如果不打算進行樣品DNA的提取，盡量選取含內參基因的上述方法（2）類和（5）類的支原體檢測試劑盒，比如：本公司的《PCR法支原體檢測試劑盒》（貨號：PM008）和本公司的《探針法法支原體檢測試劑盒》（貨號：QM016）。
??
我們選取了比較有代表性的M. hyorhinis支原體（豬鼻支原體），使用含相應M. hyorhinis支原體基因片段的質粒載體，經DNA定量后，計算出相應的分子數。
質粒經4倍系列稀釋【在每個反應管的DNA加入量為2μL的情況下，理論分子數從92200.0個稀釋到最終的1.4個】，進行相應的PCR擴增（每個稀釋度做2個重復），并對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。
為了比較不同Taq酶的擴增效果，PCR擴增時，我們同時使用了4種不同的Taq酶，分別是：（1）Takara Ex Taq Hot Start 酶【貨號：RR006A，可用400次】，（2）Takara Ex Taq酶【貨號：RR001A，可用400次】，（3）國內某品牌Taq酶，（4）Takara Taq酶【貨號：R001A】。
PCR的結果如圖2所示：
圖2. M. hyorhinis支原體質粒4倍系列稀釋的PCR擴增結果。每個稀釋度做2個重復，每個反應管的DNA加入量為2μL。586 bp條帶為內參條帶，270 bp左右的條帶為支原體特異條帶。從結果可知：（1）Takara Ex Taq Hot Start 酶的擴增結果最好（圖1A），不僅幾乎沒有引物二聚體條帶，而且檢測靈敏度最高，其檢測下限可以達到4^(-6)【含22.5個分子，條帶明顯】甚至4^(-7) 【含5.6個分子，條帶微弱】的稀釋度，即大約3-10 copies/μL；（2）Takara Ex Taq酶（圖1B）和國內某品牌Taq酶（圖1C）的擴增結果良好，但是比Takara Ex Taq Hot Start 酶的擴增結果稍差，不僅有明顯的引物二聚體條帶，而且檢測靈敏度也稍差，其檢測下限只能達到4^(-5) 【含90個分子，條帶明顯】的稀釋度，即大約45 copies/μL；（3）Takara Taq酶（圖1D）的擴增結果最差，不僅有明顯的引物二聚體條帶，而且檢測靈敏度最差，結果還非常不穩定，因此本試劑盒不能使用該酶。