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    支原體（Mycoplasma）是一種沒有細胞壁的原核生物，大小約0.3 - 0.8微米。目前，已發現的支原體品種有100多種。其中，有20種左右曾經在各種細胞培養體系中檢測到，但超過98%以上的支原體污染是由6-8種引起的。而且同一種細胞經常被多種支原體污染。

 

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    由于支原體直徑較小，經?？梢源┻^實驗室常規的0.20微米孔徑的除菌濾膜，高壓過濾時，甚至可以穿過0.10微米孔徑的除菌濾膜,造成細胞的支原體污染。細胞培養的支原體污染來源主要有：（1）細胞之間的交叉污染，這是支原體污染的最主要原因；（2）細胞培養操作人員的口腔、皮膚等。（3）細胞培養用的組分，如血清、培養液等；

    培養的細胞被支原體污染后，幾乎可以改變細胞的所有功能，其可以導致細胞染色體的異常和損傷，改變細胞的代謝、生長、形狀、附著，影響病毒的擴增能力和產量等等。例如，Miller CJ等人通過Microarray的研究表明：支原體污染嚴重改變被污染細胞的基因表達譜 [1, 2]，支原體污染后與無污染的同一細胞系相比，表達差異達2倍以上的基因就有200多個?。。。ㄔ敿殧祿堃妳⒖嘉墨I 1）。Edward Burnett 和 Liz Penn認為：被支原體污染的細胞系已經不是原來的細胞系，而是另外一個細胞系了 [3]！此外，嚴重的支原體污染將徹底摧毀一株細胞系。

   從2013年開始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及細胞培養都要進行支原體檢測。相信會有越來越多的高水平期刊將做出同樣的支原體檢測要求。

    ?總之，在細胞系上進行生物醫學方面的科學研究，如果不能保證所用的細胞系無支原體污染（Mycoplasma-free），則所得出的結論是極端不可靠甚至是完全錯誤的！可以想象：全球范圍內，每年因支原體污染導致白白浪費的科研經費的數量是多么的巨大，有人估計至少高達數十億美金！

   

    

   據Corning公司報道，世界各國的細胞系都有不同程度的支原體污染，可以說支原體污染是細胞培養領域的一個世界性問題 [4]。表1是美國ATCC、FDA、以及其他兩家細胞檢測機構的支原體污染統計數據。表2是世界各國的細胞系污染比例。目前，世界各國細胞系支原體污染的平均比例為30-60%。

 

    表1，細胞支原體污染統計結果，數據來自參考文獻 [4]

                                 

    表2，世界各國的細胞系污染比例，數據來自參考文獻 [4]

?細胞庫	USA-ATCC	USA-FDA	Germany-DSM	Argentina	Japan-IFO	China
污染率	14%	15%	36%	65%	80%	？

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    由于支原體體積比細菌小很多，通常支原體污染密度非常的高，可達10^7-9/mL培養液，但即使這么高密度的支原體污染也無法通過普通顯微鏡的肉眼觀察進行判斷。

    而且，輕度到中度的支原體污染并不會導致細胞形態或生長速度的明顯改變，也不會明顯改變培養液的渾濁度或培養液的pH值。

    以上兩個原因就導致體外培養的細胞即使被支原體污染了，一般的科研工作者也不會覺察到。也就是說：如果不進行支原體的常規檢測，你甚至不知道你培養的細胞被支原體污染了，而污染的支原體卻在悄悄改變你的實驗數據和實驗結果，你卻被蒙在鼓里！

方法一：培養法。直接將待測樣品涂布在支原體液體或固體培養基上，讓其生長，一般需要數周，才能看到菌液變渾濁或有菌落長出。 培養法是支原體檢測最經典的方法，其優點是：靈敏度適中和結果可靠。但是培養法的一個主要缺點是時間周期太長，不適合作為細胞污染的快速檢測方法。

方法二：DNA的熒光染色法。熒光染劑（如Hoechst 33258，DAPI）可以結合到細胞和支原體的DNA。被支原體污染的細胞經染色后，如果在細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一之熒光小點，即為支原體的DNA，則證明有支原體之污染。該法相對培養法快速，但是靈敏度較差。當用熒光染色法發現有支原體后，支原體的清除相對就較困難。

方法三：掃描電鏡法。將細胞樣品進行掃描電鏡拍照，如果被支原體污染可以在細胞表面看到密密麻麻的小顆粒。該方法由于要使用電子顯微鏡，不適合用作實驗室常規檢測。

方法四：PCR法。PCR法相對較快，靈敏度也較高。是目前實驗室最常用的支原體檢測方法。但是PCR法也有自己的致命缺點：細胞培養液上清常含有強烈抑制PCR擴增的代謝產物。因為很多研究人員直接使用細胞培養液上清原液進行PCR檢測，如果檢測為陰性就認為沒有支原體污染。其實，還有一種可能性，就是PCR的擴增被細胞的代謝產物抑制了，而不是沒有支原體污染！詳細情況，請參見本網站支原體檢測頁面。

    

    

    由于支原體不含細胞壁，通常使用的抑制細胞壁合成的抗生素（如青霉素等）對其沒有效果。本公司開發的支原體清除試劑1和支原體清除試劑2含有專門的支原體特效藥物，其中支原體清除試劑1

含有抑制支原體蛋白質合成的藥物，而支原體清除試劑2含有抑制支原體DNA合成的藥物。由于兩種試劑的作用機理不同，支原體清除試劑1需要處理15天，而支原體清除試劑2只需處理7天。兩者都可以達到永久殺滅和清除支原體的目的。

  ?5-10%的支原體會對清除試劑1或清除試劑2產生抗性，此外，也有3-5%左右的細胞會在殺滅支原體的過程中死亡，由于上述兩個原因，我們一般建議同時購買兩種支原體清除試劑，如果發現細胞被污染，可以將細胞分成兩份，分別用清除試劑1和清除試劑2同時進行殺滅，這樣支原體對兩種藥物同時產生抗性和處理過程中細胞同時死亡的概率會非常低。

1.     Miller CJ, Kassem HS, Pepper SD, Hey Y, Ward TH, Margison GP. Mycoplasma infection significantly alters microarray gene expression profiles. Biotechniques. 2003 Oct;35(4):812-4.

2.    Aldecoa-Otalora E, Langdon W, Cunningham P, Arno MJ. Unexpected presence of mycoplasma probes on human microarrays. Biotechniques. 2009 Dec;47(6):1013-5.

3.     Edward Burnett and Liz Penn, European Collection of Cell Culture (ECACC?). Mycoplasma Detection and Elimination. Don Finley, Market Segment Manager, Sigma? Life Science. Biofiles, Vol. 8, No. 18

4.     John Ryan (2008). "Understanding and Managing Cell Culture Contamination". Corning Incorporated. p. 24.

《支原體清除和預防試劑》使用說明書（版本20201215）

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貨號

      MR002            支原體清除試劑1

      MR003            支原體清除試劑2

運輸和儲存

      該產品在常溫下運輸，收到產品后請放于-20 ℃保存，該條件下，至少可以保存2年。

產品用途

      該產品專用于殺滅和清除哺乳動物細胞培養液中污染的支原體。該產品僅用于基礎研究，非臨床用品。

試劑盒組成

        支原體清除試劑1              1.0 mL (清除：按1:1000加入；預防：按1:5000加入)

支原體清除試劑2              1.0 mL (清除：按1:1000加入；預防：按1:5000加入)

支原體簡介

     支原體（Mycoplasma）是一種沒有細胞壁的原核生物，大小約0.3 - 0.8微米。目前，已發現的支原體品種有100多種。 由于支原體直徑較小，經?？梢源┻^實驗室常規的0.20微米孔徑的除菌濾膜，高壓過濾時，甚至可以穿過0.10微米孔徑的除菌濾膜，造成細胞的支原體污染。

     細胞培養的支原體污染來源主要有：（1）細胞之間的交叉污染，這是支原體污染的最主要原因；（2）細胞培養操作人員的口腔、皮膚等。（3）細胞培養用的組分，如血清、培養液等；

哺乳動物細胞的培養，支原體污染是個世界性的問題。目前，世界各國細胞系支原體污染的平均比例為30-60%，有些國家甚至高達80-90%。

     支原體污染幾乎可以改變細胞的所有參數，導致實驗結果的不準確、甚至完全錯誤（支原體污染對細胞的詳細危害，請參考本公司的網站：www.stylediaryblog.com）。

     從2013年開始，《Nature》期刊已正式要求投稿的文章，如涉及細胞培養都要進行支原體檢測，以保證所用的細胞沒有支原體污染。相信會有越來越多的高水平期刊將做出同樣的支原體檢測要求。

    由于支原體體積比細菌小很多，通常支原體污染密度非常的高，可達10^7-9/mL培養液，但即使這么高密度的支原體污染也無法通過普通顯微鏡的肉眼觀察進行判斷。而且，輕度到中度的支原體污染通常不會導致細胞形態或生長速度的明顯改變，也不會明顯改變培養液的渾濁度或培養液的pH值。

   以上兩個原因就導致體外培養的細胞即使被支原體污染了，一般的科研工作者也不會覺察到。也就是說：如果不進行支原體的常規檢測，你甚至不知道你培養的細胞被支原體污染了，而污染的支原體卻在悄悄改變你的實驗數據和實驗結果，你卻被蒙在鼓里！

   發現培養的細胞被支原體污染，將污染的細胞高壓蒸汽滅菌，然后丟棄是最好的選擇，這樣可以避免細胞的交叉污染。但是如果細胞比較珍貴，可以考慮用支原體清除試劑進行殺滅和清除。

產品簡介

   本公司開發的支原體清除試劑1含有抑制支原體蛋白質合成的藥物，而支原體清除試劑2含有抑制支原體DNA合成的藥物。由于兩種試劑的作用機理不同，支原體清除試劑1需要處理不少于15天，而支原體清除試劑2只需處理7天。兩者都可以達到永久殺滅和清除支原體的目的。

    大約5-10%的支原體會對清除試劑1或清除試劑2產生抗性，此外，也有3-5%左右的細胞會在殺滅支原體的過程中死亡，由于上述兩個原因，我們一般建議同時購買兩種支原體清除試劑。如果發現細胞被污染，可以將細胞分成三份：第一份添加清除試劑1，第二份添加清除試劑2，第三份同時添加清除試劑1和清除試劑2進行殺滅，這樣支原體對兩種藥物同時產生抗性和處理過程中細胞同時死亡的概率會非常低。

使用方法

（一）支原體清除試劑1

1. 使用之前，先將支原體清除試劑1用PBS或者無血清培養液稀釋10倍后，放4℃冰箱保存。

2. 將50-100萬個細胞鋪到60 mm的細胞培養皿內，加入4 mL含支原體清除試劑1的正常細胞培養液（使用稀釋10倍后的支原體清除試劑1，按1:100比例加入）。

3.每2-3天更換細胞培養液。換液時，用PBS沖洗2-3遍細胞，以將死亡的支原體清洗干凈。而后加入新鮮的含支原體清除試劑1的正常細胞培養液。期間如果細胞密度過大，請保持細胞密度適當（貼壁細胞可能需要胰酶消化），并更換新的培養皿。

4. 處理15天后，可以用支原體檢測試劑盒進行檢測，檢測支原體是否殺滅完全。如果仍有支原體殘留，可以考慮再處理6天。

5. 以后每隔1個月進行支原體的常規檢測，以保證沒有新的支原體污染。

（二）支原體清除試劑2

1. 使用之前，先將支原體清除試劑2（注意：支原體清除試劑2在-20 ℃保存后，解凍時可能會有細小的結晶析出）用PBS或者無血清培養液稀釋10倍后（此時，支原體清除試劑2應該徹底溶解），放4℃冰箱保存。

2. 將50-100萬個細胞鋪到60 mm的細胞培養皿內，加入4 mL含支原體清除試劑2的正常細胞培養液（使用稀釋10倍后的支原體清除試劑2，按1:100比例加入）。

3.每1-2天更換細胞培養液。換液時，用PBS沖洗2-3遍細胞，以將死亡的支原體清洗干凈。而后加入新鮮的含支原體清除試劑2的正常細胞培養液。期間如果細胞密度過大，請保持細胞密度適當（貼壁細胞可能需要胰酶消化），并更換新的培養皿。

4. 處理7天后，可以用支原體檢測試劑盒進行檢測，檢測支原體是否殺滅完全。如果仍有支原體殘留，可以考慮再處理3天。

5. 以后每隔1個月進行支原體的常規檢測，以保證沒有新的支原體污染。

注意事項

? 建議將細胞分成三份：第一份添加清除試劑1，第二份添加清除試劑2，第三份同時添加清除試劑1和清除試劑2進行殺滅（注：同時添加兩種藥物可能對細胞的毒性較大，但是殺滅的概率會非常高），這樣支原體對兩種藥物同時產生抗性和處理過程中細胞同時死亡的概率會非常低。如果同時添加清除試劑1和清除試劑2，細胞可以每2天更換一次培養液。

? 處理過程中，注意每天觀察細胞的狀況，如果發現支原體清除試劑對細胞的毒性較大，可以加大培養液中的血清濃度或者提高細胞的密度。

? 清除試劑1和清除試劑2在降低濃度后（使用稀釋10倍后的支原體清除試劑1或者2，按1:500比例加入）也可以加入到培養液中作為短期（1-2個月）的支原體污染預防藥物，但是不建議在細胞培養液中長期（超過2個月）加入，因為有可能導致對該兩種藥物有抗性的支原體出現。

        

        如上圖所示，左側為未經支原體清除試劑處理的人Hela細胞,經DAPI染色后，除了細胞核為藍色外，細胞質也有大量的絮狀核酸物質被染成藍色，這些處于細胞質的核酸物質就是支原體DNA。而右側為經過本公司的支原體清除試劑2處理7天的Hela細胞，經DAPI染色后，除了細胞核為藍色外，細胞質沒有任何絮狀核酸物質被染成藍色，說明支原體已經被清除。

        鑒于DAPI染色法的靈敏度較低，支原體是否被徹底清除還需要用更靈敏的方法進一步檢測確認，如使用本公司的四款快速《支原體檢測試劑盒》進行確認。

        盜圖必究！

1.       細胞生物學：支原體污染將直接導致最常用的MTT細胞毒性實驗結果的嚴重錯誤！

 

l  結果：由于支原體對MTT的額外還原作用，對阿霉素（Doxorubicin, 一種抗腫瘤藥物）的抗性，支原體污染和非污染的細胞二者相差15倍?。?/span>Due to an additional reduction of tetrazolium by mycoplasmas, contaminated cells appeared up to 15 fold resistant to doxorubicin.）

l  參考文獻：Falsification of tetrazolium dye (MTT) based cytotoxicity assay results due to mycoplasma contamination of cell cultures. Anticancer Res. 1999 Mar-Apr; 19(2A):1245-8.

 

2.       免疫學：支原體污染本身將可以直接誘導樹突狀細胞的成熟！這對于目前國內外普遍開展的人體免疫細胞的腫瘤治療將是災難性的。

 

l  結果：（1）The capacity of these cell lines to induce DC maturation was due to their contamination by mycoplasma. Our results reveal that DC are able to sense mycoplasma infection and mature as they do in response to most viruses and bacteria. （2）Further investigation demonstrated that the changes in DC phenotype and functions were due to the presence of mycoplasmas in these two cell lines; eradication of mycoplasmas completely abolished the observed effects, and importantly, pure mycoplasmas in the absence of tumor cell supernatants were able to produce the same effects.

l  參考文獻：（1）Dendritic cell maturation is induced by mycoplasma infection but not by necrotic cells. Eur. J. Immunol. 2000. 30: 705–708。（2）Mycoplasma-mediated alterations of in vitro generation and functions of human dendritic cells. J Biomed Sci. 2005;12(1):31-46.

 

3.       神經生物學：支原體污染本身可以直接降解淀粉樣多肽Amyloid-beta (Abeta)！

 

l  結果：These data show that mycoplasmas degrade Abeta and thus may represent a significant source of variability when comparing extracellular Abeta levels in different cell lines.

l  參考文獻：（1）Amyloid-beta peptide degradation in cell cultures by mycoplasma contaminants. BMC Res Notes. 2008 Jun 30;1:38. （2）Neuroprotective effects of Mycoplasma hyorhinis against amyloid-β-peptide toxicity in SH-SY5Y human neuroblastoma cells are mediated by calpastatin upregulation in the mycoplasma-infected cells. Neurochem Int. 2011 Mar;58(4):497-503.

 

4.       生物化學：支原體污染可以直接影響L-arginine的代謝！

 

l  結果：This demonstrates that infection with M. hyorhinis leads to different effects on gene regulation of the murine and human iNOS gene. Our study underlines the importance of routine checking of cell cultures for mycoplasma contamination, particularly in studies on NO-mediated effects or inflammatory processes.

l  參考文獻: Impact of Mycoplasma hyorhinis infection on L-arginine metabolism: differential regulation of the human and murine iNOS gene. Biol Chem. 2005 Oct;386(10):1055-63.

 

5.       病理學：支原體污染可以直接刺激前列腺素E2（Prostaglandin E2）的產生！

 

l  結果：Mycoplasma fermentans (MF) also stimulated PGE(2) production. The co-infection of mycoplasma and Chlamydia resulted in an additive effect in the production of PGE(2). Thus it is important to use host cells and Chlamydia free of mycoplasma contamination for the analysis of Chlamydia-induced prostaglandin production.

l  參考文獻:Production of prostaglandin E2 in monocytes stimulated in vitro by Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, and Mycoplasma fermentans. Microb Pathog. 2004 Sep;37(3):155-61.

 

產品名稱：《支原體清除1》；包裝規格：1.0 mL（1000x）；貨號：MR002；價格：580元。?

產品名稱：《支原體清除2》；包裝規格：1.0 mL（1000x）；貨號：MR003；價格：580元。?